Name: induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen&#39;e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT&#39;ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.

1. Fly Haçlar ve Klon İndüksiyonu <ol><li> Bakire flies toplamadan önce flakona 12 saat boyunca tüm sinekler çıkarın. </li><li> Şişe içindeki sinekleri CO 2 gazı enjekte ederek anestezi altına alın ve CO 2 sineklik pedi üzerine sinek yerleştirin. </li><li> 10 - 20 bakire dişiyi ve 10 erkek, CO 2 sineklik pedinden yeni bir tüp içine aktarın ve 1 gün süreyle 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu sinekleri yeni bir flakona aktarın ve 12 saat 25 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: Bakire dişiler ilk gün yeterli miktarda yumurta bırakmadığı için ilk flakonu atın. </li><li> Geliştirici-GAL4 hatları için, yetişkin sinekleri çıkarın ve diseksiyona kadar 25 ° C&#39;de flakonu inkübe edin. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için, yetişkin sinekleri çıkarın ve 25 ° C&#39;de 2-4 gün inkübe edin. Isı şoku öncesi inkübasyon süresi deneysel amaca bağlıdır. Yumurta tortulaştırmasından 2 gün sonra bir ısı şoku (AED) olgunlaşmamış ikinci mozaik klonlar üretirInstar imaginal epitel. 3 veya 4 gün sonra bir ısı şoku AED, erken-orta üçüncül instar imaginal epitelyumda ayırt edilen mozaik klonlar üretir. NOT: Değiştirilmiş ısı şoku zamanlamasının tümöre özgü fenotipler üzerindeki etkisini incelemek önemlidir. </li><li> Mozaik klonların flip-out-GAL4 ile indüksiyonu için flakonu, 37 ° C&#39;lik bir su banyosuna 10-45 dakika batırın, ardından 25 ° C&#39;de 2 - 3 gün inkübe edin. NOT: Her bir deneydeki ısı şoku zamanı, zamanlaması ve kuluçka süresi bilgileri şekil şekillerinde gösterilmiştir. </li></ol> 2. Larvaların Diseksiyonu <ol><li> Bir flüoresan stereoskopik mikroskop altında uygun floresan işaretleyiciler ( örn. , EGFP) tarafından genotip onları ahşap bir sopa veya künt forseps ile dolaşıp üçüncü instar larvaları toplayın ve onları PBS (fosfat tamponlu salin) ile bir diseksiyon çanak yerleştirin. </li><li> 2 mL plastik transfer pipet ile pipetleme PBS içinde larvaları yıkayın. </li><li>Bir forsepsle larva merkezini sıkıştırın ve diğer forsepslerle vücudunuzu yarısı kadar yırtın. </li><li> Ön yarımın ağız kancasını bir forsepsle sıkıştırın ve vücudu içeri doğru dışarı çevirmek için ağzı diğer forsepslerle vücuda doğru itin. </li><li> Tükrük bezleri veya yağ cisimleri gibi gereksiz malzemeleri forsepsle çıkarın. </li></ol> 3. Fiksasyon ve Antikor Boyama <ol><li> 1.5 mL&#39;lik bir plastik tübün içine larval gövdenin (yarı kanat diskleri dahil) disseke edilmiş ön yarısını aktarın ve yumuşak rotasyon ile karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca Fix çözeltisinin 1 mL&#39;sinde (PBS&#39;de% 4 formaldehid) sabitleyin. DİKKAT: Formaldehit zehirlidir ve kanserojen potansiyeline sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. NOT: Bu bölümde, aksi belirtilmediği sürece, tüm basamaklar karanlıkta oda ısısında bir besleyicide gerçekleşir. </li><li> Fix çözümünü çıkarın ve atın. Dokuları 1 mL PBT (% 0.3 TritPBS&#39;de X-100 üzerinde) üç kez üç kez 15 dakika boyunca uygulandı. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve 1 saat süreyle oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C&#39;de 1 saat süre ile bloke edip 1 saat süreyle bekletin. PBTG (PBT&#39;de% 0,2 sığır serumu albumin ve% 5 normal keçi serumu) 1 mL ekleyin. </li><li> PBTG&#39;yi çıkarın ve PBTG ile uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 4 ° C&#39;de hafifçe kavrayın. </li><li> Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile üç kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> PBT&#39;yi çıkarın ve PBTG (1: 400) ile uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca veya 4 ° C&#39;de gece boyunca nutatlayın. </li><li> İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> F-aktin lekesi için, PBT&#39;yi çıkarın ve PBS (1:40) içinde uygun şekilde seyreltilmiş Phalloidin çözeltisi ekleyin. Sonra 20 dakika boyunca kestirin. Phalloidin çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Nükleer DNA&#39;yı kontrast haline getirmek için PBT&#39;yi çıkarın ve DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisini ekleyin (PBS içerisinde 0.5 μg / mL DAPI). Sonra 10 dk. DİKKAT: DAPI kanserojen potansiyele sahiptir. Cilt ile temasını önlemek için koruyucu eldiven ve kıyafetler giyin. </li><li> DAPI çözeltisini çıkarın ve dokuları 1 mL PBT ile iki kez 15 dakika boyunca yıkayın. </li><li> 1 mL PBS&#39;de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir kez yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi çıkarın ve ön montaj ortamı olarak 500 μL% 100 gliserol ekleyin. </li></ol> 4. Mikroskop Slaytlarına Monte Edilmesi <ol><li> 2 mL plastik transfer pipet kullanarak mikroskop lamı üzerine lekelenmiş dokuları yerleştirin. </li><li> Dokuları, forseps ile başka bir mikroskop slayt üzerinde montaj orta damla için aktarın. </li><li> Diseksiyon dokusunun ucunu bir forsepsle basılı tutun ve diğer forsepslerle beyin ve göz antennal disklerini çekin. NOT: Parçalanmış beyinleri kanat görüntü disklerine yakın konumda tutun. Beyin, lamellerin kanat imgesel disklerini ezmesini engelleyen bir platform gibi hareket eder. </li><li> Kanat imaginal disklerini izole etmek için diseksiyon yapılan dokunun ucunu bir forsepsle tutun ve vücut duvarını hafifçe çizin ve diğer forsepslerle diskleri yırtın. NOT: Kanat imaginal diskleri bulmak zorsa, trakeayı posteriordan anteriora doğru soyun. Kanat imaginal diskleri trakeaya yapışır. </li><li> Düşünceli diskleri bir lamel ve nail polisaj ile hafifçe örtün; 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskopi <ol><li> Bir konfokal mikroskop kullanarak konfokal görüntüler elde etmek için emisyon dalga boyu aralığı, lazer yoğunluğu, kazanç, ofset, tarama hızı ve görüntü boyutu dahil olmak üzere görüntü toplama parametreleri ayarlayın 24 . NOT: Görüntü elde etme ayarlarının ayrıntılı prosedürü için, her mikroskop üreticisinin verdiği kullanım kılavuzuna bakın. </li><li> Tek bir ortak yakalamak içinTüm kanat imgesel diskinin nfokal bölümleri, 20X nesnel bir lens kullanın. </li><li> 40X veya 60X mercekleri kullanarak 0,5 - 1,0 μm adım boyutunda z-yığın taraması ile 3 boyutlu görüntüler elde edin. NOT: Yüksek çözünürlükte hücresel fenotipleri analiz etmek için bir görüntü boyutu 512 x 512 pikselden daha büyük olmalıdır. </li></ol> 6. ImageJ kullanarak Görüntü Analizi <ol><li> Konfokal z-yığın görüntülerini elde etmek ve analiz etmek için biyolojik görüntü analizine (https://fiji.sc/) 25 odaklanmış açık kaynaklı ImageJ yazılımı olan Fiji&#39;yi kullanın. </li><li> Dikey bölümler elde etmek için, ImageJ&#39;deki z-yığın görüntülerini açın ve &quot;Image / Stacks / Reslice&quot; menü öğesini seçin. NOT: Reslice menüsünde XZ ekseni veya YZ ekseni seçilebilir. Düşey kesit, z-yığın resmine düz bir çizgi veya dikdörtgen çizerek keyfi bir yönde de elde edilebilir. </li></ol> 7. Neoplastik Fenotiplerin Teşhisi <ol><li> Dikey açmaBir dizi z-yığın görüntüsünden elde edilen kesitler (XZ veya YZ ekseni) ve morfolojik fenotipleri ve antikor boyamasını analiz eder. </li><li> Tümör fenotiplerinin teşhisi için, esas olarak aşağıdaki üç noktaya odaklanmak: (1) knockdown klonları da dahil olmak üzere bir hücre kitlesi ana epitel tabakasından saparsa, (2) junctional proteinlerin subselüler lokalizasyonu bu hücre kütlesi içinde değişirse Ve (3) eğer bu hücre kütlesinin çapı 4 hücreden büyükse. </li><li> Şekil 1&#39;de açıklanan akış şemasına göre tümör fenotiplerini kategorize edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+cancer.">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila.">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li><li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role.">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li><li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila.">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li><li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis.">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li><li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+polarity+and+proliferation+control:+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors.">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li><li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble/Dlg/Lgl+polarity+module.">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li><li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+alterations+in+carcinoma:+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators.">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila.">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li><li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger/TNF+signaling+in+Drosophila.">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li><li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Lgl+and+Mahjong/VprBP+in+cell+competition.">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).</li><li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter.">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li><li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition.">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li><li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia.">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li><li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots,+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment.">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).</li><li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila.">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li><li>Men&#233;ndez, J., P&#233;rez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway.">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li><li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells.">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li><li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells.">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li><li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells.">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li><li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels.">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li><li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EDAC:+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals.">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+6,300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li><li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila.">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li><li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc,+Yorkie,+Wingless+and+ribosome+biogenesis.">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li><li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states.">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li><li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior.">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li><li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics.">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li><li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+design:+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood.">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li><li>Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation.">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li><li>Colombani, J., Andersen, D. S., L&#233;opold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing.">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li><li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation.">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26&#39;da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç ​​aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökülmesini veya kanserojenlerin aşırı ekspresyonunu sağlayan klonların üretilmesini sağlar. GAL4 arttırıcı tuzak hatları veya Janelia GAL4 hatları 27 gibi arttırıcı dizilerle düzenlenen GAL4 sürücü çizgileri benzersiz, zamana bağlı olarak sınırlanmış ifade şekillerine sahiptir. Dolayısıyla, bu arttırıcı-GAL4 çizgileri, imgesel disklerin kısıtlı alanlarında tutarlı bir şekilde tümörleri indüklemek için yararlıdır. Bu çalışmada gösterilen sd-GAL4 ve upd- GAL4&#39;e ilaveten, lgl- knockdown&#39;un indüklediği bEngleiled-GAL4 ( en-GAL4 ), kirpi-GAL4 ( hh-GAL4 ), optomotor-kör-GAL4 ( omb-GAL4 ), yamalı-GAL4 ( ptc-GAL4 ) ve spalt-majör- GAL4 ( salm-GAL4 ), kanat imgesel disklerinin menteşe bölgelerinde neoplastik tümörler oluşturabilir. Geliştirici-GAL4 ifade şablonu geçici olarak kontrol edilmesi gerekiyorsa, GAL4 ve sıcaklık duyarlı GAL80 versiyonu (GAL80 ts ) kombinasyonu bir seçenektir. GAL80 ts , 18 ° C&#39;de GAL4 fonksiyonunu bastırır, ancak 29 ° C&#39;de değil, UAS transgen ekspresyonunun gerekli olduğu gibi açılıp kapatılmasına izin verir 28 . FLP-FRT sistemi ve GAL4-UAS sistemi 3&#39;ü bir araya getiren flip-out-GAL4 mozaik sistemi, imgesel disklerde rasgele klonlar üretir. Isı şokuyla uyarılabilir flippaz&#39;ı (hsFLP) flip-out GAL4 ile birleştirerek, klon üreticisinin zamanlamasıIyon kontrol edilebilir. Hayali disk hücrelerinin tümörijenik potansiyel gelişimsel aşamada, endojen sinyal olayları, ve / veya hücresel farklılaşma 29, 30 bağlı olabilir, çünkü tümörijenik fenotiplere değiştirilmiş ısı-şok zamanlama etkisini incelemek için çok önemlidir. NTSG mutant klonlarının, vahşi tip hücreler 10 , 11 , 12 , 18 ile çevrildiğinde, hücre rekabetine bağlı apoptoza maruz kaldıkları gösterilmiş olup, kanser gelişiminde hücre dönüşümü için birden fazla mutasyon gerektiğini düşündürmektedir. Aslında, lgl veya dikenli mutant klonlardaki onkojenik Ras veya Yki&#39;nin aşın ekspresyonu onları agresif tümörler 10 , 18 , 31&#39;e dönüştürürken , yanlışRas V12 veya Yki 3SA ifadesi nTSG mutasyonlar olmadan kendileri tarafından malign neoplazmı yol açmaz. Burada ve daha önce gösterildiği gibi 16 , vahşi kanat disklerinde üretilen pro-tümör nTSG knockdown klonları da apoptozdan geçmekte ve kanat çantasında 16 tümörigenez göstermemektedir. Aynı zamanda, menteşe &quot;sıcak noktalarda&quot; yer alan nTSG knockdown klonları, ek onkojenik mutasyonlar olmaksızın neoplastik tümörlere dönüşür. Menteşe bölgelerinde, nTSG eksikliği olan hücreler, tümojenezisi 16 tahrik etmek için endojen Janus kinaz / sinyal transdüseri ve transkripsiyon aktivatörünü (JAK / STAT) kaçırır. Bu nedenle, upd -GAL4 gibi menteşeye özgü GAL4&#39;ler, tümör süpresör genlerin RNAi aracılı knockdown tarafından sürekli olarak neoplastik tümör oluşumunu indüklemek için yararlı araçlardır. Flip-out-GAL4 ile indüklenen nTSG knockdown mozaik klonlar menteşe rektöründe neoplastik tümörleri indüklemekle birlikteTümör oluşumu, ilk klon boyutuna bağlıdır: 20 dakika boyunca bir ısı şoku tarafından üretilen büyük klonlar genelde tümörigeneze neden olurken, ısı şokunun 10 dakikadan kısa sürede üretilen çoğu küçük klon tamamen yok edilir (KM ve YT, yayınlanmamış veriler). Tümör gelişimi ve kanser progresyonu üzerine yapılan bir dizi son araştırma Drosophila imaginal diskleri bir model sistem olarak kullanmaktadır 32 , 33 . Bu çalışmalara ortak olarak, neoplastik tümörlerin saptanan belirteçleri vardır: sapma hücre kitleleri, deforme disk şekilleri, F-aktin birikimi, hücre döngüsünün arttırılması (BrdU / EdU birleşimi veya PH3 ekspresyonu), JNK sinyalleşmesinin aktivasyonu ve onun aşağı doğru hedef MMP1, bazal membran (Crumbs, Stardust, PatJ, aPKC, Bazooka / PAR-3 veya PAR-6) yer alan proteinlerin kayıp veya subselüler delokalizasyonu da dahil olmak üzere, parçalanma ve / veya epitel disorganizasyonu, septat kavşakları(Lgl, Scrib, Dlg veya Coracle) veya adherens kavşakları (E-Cadherin veya Armadillo). Bu fenotipler, klasik antikor boyaması ile kolaylıkla saptanabilir. Bir klonal fenotipin hiperplazi, displazi, benign neoplazma veya malign neoplazm olup olmadığını belirlemek tümörizmin erken evrelerinde zor olsa da, tek bir epitelyal tek tabaka içeren Drosophila imaginal disk epitelyumunda daha basit olmalıdır. Bu çalışmada, epitelyal tek tabaka içerisinde indüklenen tümörlü klon fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunuldu ( Şekil 1 ). Bu yöntem, z-stack konfokal görüntüler kullanarak beş kritere dikkatle gözlem yapmayı gerektirir; Her teşhis kriterleri konvansiyonel antikor boyama ve konfokal görüntüleme ile incelenebilir. Bu yöntemde getirdiğimiz yeni kriterlerden birisi, imgesel disklerde displazi ve neoplazm arasında ayrım yapan &quot;4 hücre çapı ölçütleri&quot; dir. NTSG mutant klonları gibi pro-tümör hücreleri sıktırEpitelyal tabakalardan hücre rekabeti ya da iğ aksın yönlendirilmesi yoluyla ekstrüzyona tabi tutuldu. 15 , 16 , 34 . Çoğu durumda, bu ekstrüze edilen hücreler apoptoz verir ve bu nedenle çoğalamazlar. Prote-tümör hücrelerin ekstrüzyon sırasında bir kez ve ekstrüzyon sonrasında bir veya iki kez daha hücre bölünmesine uğraması mümkün olmasına rağmen, bu 2-3 hücre çapında bir hücre kitlesi oluşturur. Bu nedenle, epitelyal tabakadan sapmış pro-tümör hücrelerinin bir hücre kütlesi 4 hücreli çaptan büyükse, bunların epitel tabakasının dışındaki bir neoplazma olarak hayatta kaldıklarını ve prolifere olduklarını belirleyebiliriz. Bu tanı yöntemi basit olmakla birlikte, tümör gelişim ve malignite süresi boyunca ilerledikçe, fenotiplerin zaman içerisinde alınması önemlidir. Örneğin, displazi sitolojik açıdan anormal bir dokudur ve tamamen iyi huylu büyüme ile ön olanlarla olan geçiş halidirMalign. Dolayısıyla, gözlenen bir klon, akış şemasına göre bir displazi olarak tanımlansa bile ( Şekil 1 ), displazi daha sonra bir neoplazmaya dönüşebilir. Larva evresi zamanla sınırlı olmakla birlikte (25 ° C&#39;de 5-6 gün veya 29 ° C AED&#39;de 4-5 gün), imgesel disklerde tümör büyümesi larval aşamayı insülin benzeri bir peptitle indüklenen parianasyon gecikmesi ile uzatır 35 , 36 . Bu nedenle, imgesel disklerde neoplastik tümör oluşumu, birkaç gün daha tümör klon fenotipik ilerlemesini gözlemlemeyi mümkün kılar. Basit sınıflandırma yöntemimiz, Drosophila&#39;daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.

Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu &quot;tümör öncesi hücre&quot;, baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağanüstü teknolojik gelişmeler kanser araştırmaları konusunda kayda değer ilerlemeler kaydetti. Özellikle, Drosophila melanogasterinde genetik olarak mozaik analiz araçlarını kullanan, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase hedefi) mitoz rekombinası gibi son çalışmalarAtion 2 ve flip-out-GAL4-UAS (upstream aktivasyon dizisi) sistemleri 3 , tümörler 4 , 5 , 6&#39;nın oluşumu ve metastazında rol oynayan genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük katkı sağladı. Korunmuş Drosophila tümör süpresör genleri, ölümcül dev larvalar ( lgl ), büyük diskler ( dlg ) ve karalamalı ( scribble ) bir grup üzerinde yapılan çalışmalar, bu genlerin önemli rol oynadığı için epitel organizasyonu kaybı ile tümör gelişimi arasındaki kritik ilişkiyi vurguladı Epitelyal dokularda apikal-bazal hücre polaritesi ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde 7 . Drosophila imaginal diskleri normal olarak tek tabaka epiteliyken, bu üç genin herhangi birindeki homozigot mutasyonlar, hücrelerin yapısını ve polaritesini kaybetmesine neden olur, farklılık oluşturmazlarKirletir, aşırı yayar ve nihayetinde komşu dokularla kaynaşan çok tabakalı amorf kütleler oluşturur 7 . Benzer bir şekilde, memelilerde, bu genlerin bozulması, kötü huylu tümörlerin 8, 9 gelişiminde ilgilenmektedir. Mutant dokular tarafından sergilenen neoplastik fenotipler, bu üç genin korunmuş, neoplastik tümör baskılayıcı genler (nTSG&#39;ler) 7 , 8 olarak sınıflandırılmasına yol açtı. Homozigot nTSG mutant hücrelerinin düzensiz FLP FRT aracılı mitotik rekombinasyon kullanılarak vahşi tip hayali diskler geliştirilmesinde oluşturulur Bununla birlikte, mutant hücreler, c-Jun N-terminal kinazın (JNK) bağlı apoptoz 10, 11 aracılığıyla dokunun elenir , 12 , 13 , 14 , ekstrüzyon 15 </suP&gt; , 16 veya komşular tarafından yutkunma ve fagositoz 17 . Bu genetik olarak mozaik epitelyumda, apoptoz çoğunlukla klon sınırında yer alan nTSG mutant hücrelerinde saptanır ve bitişik normal hücrelerin nTSG mutant hücrelerinin apoptozunu tetiklediğini düşündürür. Bu , 10 , 11 , 12 , 18 . Memeli hücrelerinde yapılan son çalışmalar bu tümör öncesi hücrelerin hücre rekabetine bağlı eliminasyonunun kansere karşı evrimsel olarak korunmuş epitelyal bir kendini savunma mekanizması olduğunu doğruladı 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Bununla birlikte, Drosophila imaginal disklerinde yapılan yeni bir çalışmada, mozaik nTSG knockdown klonlarının spesifik olarak neoplastik tümörleri indüklediği gösterilmiştirKanat imgesel disklerin buz bölgeleri 16 . Başlangıçtaki tümör oluşumu periferik &quot;menteşe&quot; bölgesinde daima bulundu ve kanat disk epitelinin merkezi &quot;kese&quot; bölgesinde asla gözlenmedi, bu, nTSG knockdown hücrelerinin tümörojenik potansiyelinin yerel ortama bağlı olduğunu düşündürdü. Merkezi kese bölgesi, pro-tümör hücrelerinin displastik aşırı büyüme göstermediği bir &quot;tümör soğuk noktası&quot; olarak işlev görürken, çevresel menteşe bölgesi &quot;tümör sıcak noktası&quot; olarak davranır 16 . &quot;Soğuk nokta&quot; kese bölgelerinde, nTSG knockdown hücreleri bazal taraftan laminatlaşır ve apoptozise girer. Aksine, &quot;sıcak nokta&quot; menteşe hücreleri, bazal yanlarında sağlam bir sitokkelet yapıları ağı bulunduğundan, nTSG knockdown hücreleri epitelin apikal yanından kat katlanır ve tümöre özgü aşırı büyümeyi başlatır 16 . Bu nedenle, imgesel disklerdeki tümör fenotiplerinin analizi dikkatli bir şekilde yapılmasını gerektirirTümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik yatkınlığın azalması. Burada, normal kanat disk epitelinde nTSG knockdown hücrelerinin üretildiği GAL4-UAS- RNAi sistemini kullanan Drosophila kanat imaginal disklerinde neoplastik tümör oluşumunu indükleyen bir protokolü açıkladık. Bu deneysel sistemler kanserin erken safhalarını incelemek için yararlı olsa da, imaginal disk epitelyumundaki tümör progresyon evrelerini değerlendirmek için açık bir sınıflandırma yöntemi daha önce açıklanamamıştır. Bu nedenle, kanat diski epitelyumunda indüklenen tümör öncesi klonal fenotipleri üç kategoriye ayırmak için bir teşhis metodu öneriyoruz: Hiperplazi (artmış proliferasyonu olan aşırı miktarda normal görünen hücrelerin birikimi), displazi (anormal olarak görülen premalign doku Hücreler) ve neoplazi (benign veya malign tümör, anormal görünüm ve anormal proliferasyon paternine sahip hücrelerden oluşur).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-&lt;span class=&quot;font13&quot;&gt;a&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font8&quot;&gt;tubulin&lt;/span&gt;</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>dilute in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td><td>Molecular probes</td><td>A22283</td><td>dilute in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546</td><td>Molecular probes</td><td>A11030</td><td>dilute in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fly strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;sd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;upd-Gal4&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-lgl-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-scrib-RNAi&lt;/em&gt;</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Ras&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;V12&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Yki&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3SA&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;hsFLP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Act&gt;CD2&gt;GAL4 (flip-out GAL4)&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>recombined with &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;font11&quot;&gt;UAS-EGFP&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-EGFP&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>second chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-Dicer2&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>third chromosome</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;vkg-GFP&lt;/em&gt;</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP protein trap</td></tr></tbody></table>

induction and diagnosis of tumors in drosophila imaginal disc epithelia

Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç ​​evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila&#39;daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia at JoVE.com

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disk Epiteli

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

induction-diagnosis-tumors-drosophila-imaginal-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

14.9K Görüntüleme.  SOKENDAI.  Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız. 

Video: Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Biyoloji

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more than 50 histological subtypes of these rare solid tumors have been identified. Thus, due to their extraordinary diversity and low incidence, our understanding of the biology of these tumors is still limited. Patient-derived cultures represent the ideal platform to study STS pathophysiology and pharmacology. We thus developed a human preclinical model of STS starting from tumor specimens harvested from patients undergoing surgical resection. Patient-derived STS cell cultures were obtained from the surgical specimens by collagenase digestion and isolated by filtration. Cells were counted, seeded, and left for 14 days in standard monolayer cultures and then processed by downstream analysis. Before performing molecular or pharmaceutical analyses, the establishment of STS primary cultures was confirmed through the evaluation of cytomorphologic features and, when available, immunohistochemical markers. This method represents a useful tool 1) to study the natural history of these poorly explored malignancies and 2) to test the effects of different drugs in an effort to learn more about their mechanisms of action.

The following protocol focuses on the establishment of a primary culture of patient-derived soft tissue sarcoma (STS). This model could help us to better understand the molecular background and pharmacological profile of these rare malignancies and could represent a starting point for further research aimed at improving STS management.

Hasta elde edilen yumuşak doku sarkomu birincil kültürünün kurulması

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Drosophila has illuminated our understanding of the genetic basis of normal development and disease for the past several decades and today it continues to contribute immensely to our understanding of complex diseases 1-7. Progression of tumors from a benign to a metastatic state is a complex event 8 and has been modeled in Drosophila to help us better understand the genetic basis of this disease 9. Here I present a simple protocol to genetically induce, observe and then analyze the progression of tumors in Drosophila larvae. The tumor induction technique is based on the MARCM system 10 and exploits the cooperation between an activated oncogene, RasV12 and loss of cell polarity genes (scribbled, discs large and lethal giant larvae) to generate invasive tumors 9. I demonstrate how these tumors can be visualized in the intact larvae and then how these can be dissected out for further analysis. The simplified protocol presented here should make it possible for this technique to be utilized by investigators interested in understanding the role of a gene in tumor invasion.

A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster

Cooperation between an activated oncogene like RASV12 and mutations in cell polarity genes like scribbled, result in tumor growth in Drosophila where tumor cells also display invasive behaviors. Here a simple protocol for the induction and observation of the benign and invasive tumors is presented.

Arasında Cephalic Kompleksi Genetik İndüksiyon ve Benign ve İnvaziv vizüalizasyonun için Protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila has illuminated our  understanding of the genetic basis of normal development and disease for the  past several decades and today it continues ...

Tıp

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Gelişim Biyolojisi

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Drosophila Larva Imaginal Disc Dissection: A Method to Observe Developing Epithelia

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. <a href="https://www.jove.com/video/55901/" target="_blank">Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia</a>. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila imaginal discs, often a rough dissection is performed where the discs are exposed but remain attached to the body. Once stained, the discs of interest are isolated and mounted. The example protocol demonstrates a procedure for wing imaginal disc dissection and mounting.

Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Source: Morimoto, K. and Tamori, Y. Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia. J. Vis. Exp. (2017).
When staining Drosophila ...

Tümörlerin İndüksiyon ve Teşhisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler