Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, tek molekülleri kuvvetle manipüle etmemize izin vererek atomik ölçekte moleküler biyoloji hakkında muazzam bilgiler sağlayabilir. Burada, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sabit bir hız ölçümü gösteriyoruz. Sonuçta protein kararlılığını belirlemek için verileri kullanabilirsiniz, açılma hızı, ve açılma yolu.
Yordamı başlatmak için, 15 milimetre genişliğindeki temiz bir demir diske iletken olmayan bir yapışkan sekmesi takın. Kapak sayfasını çıkarın ve açıkta kalan yapıştırıcının üzerine temiz, kaplamasız veya altın kaplı cam bir kaydırağa sıkıca basın. Kaydırağı temiz, kapalı bir Petri kabında saklayın.
Daha sonra, arınmış poliproteini bir santrifüj süzgeçte yoğunlaştırın, ardından kolontersine çevirin ve deneyde kullanılmak üzere proteini tampona dönüştürün. 280 nanometredeki absorbansa göre uygun protein konsantrasyonu belirleyin ve sonra proteinin mililitre çözeltisi başına 100 mikrogram 100 mikrolitre hazırlayın. Protein çözeltisinin 60 mikrolitrelik damlasını slaytın ortasına uygulayın.
Bu, deney sırasında kontrolsüz numune hareketlerine yol açacağından, sıvının slayt ve demir disk arasında kaymasına izin vermemeye dikkat edin. Numune nin oda sıcaklığında en az 10 dakika oturmasını bekleyin. İlk olarak, dikkatlice sonuna kadar kantilever almak ve sonda tutma hücresine yerleştirin.
Kantilin sıkıca oturduğundan emin olun. Ardından tutucu hücreyi AFM kafasına yerleştirin. Başı ters bir mikroskop aşamasına ayarlayın ve lazere güç sağlamak için bir pil takımını AFM kafasına bağlayın.
Bir monitör veya TV ekranında lazer ışığını görselleştirmek için mikroskop dedektörü için bir kamera ayarlayın. Mikroskop tarafından yönlendirilen lazer, kantilever ucuna yönlendirilen şekilde konumlandırın. Numune hazır olduğunda, deney tamponunun 10 mikrolitresini sonda tutan hücrenin her bir noktasına boşaltın.
Örnek slayttan yaklaşık 40 mikrolitre sıvı çıkarve 40 mikrolitre arabellek ekleyin. Bu arada, ölçüm için atomik kuvvet mikroskobu hazırlamaya başlayın. İlk olarak, piezo motor üzerinde mıknatıs üzerinde slayt yerleştirin.
AFM aşamasının yüksek konumda olduğunu doğrulayın ve afm kafasını örnek damlacıkların üzerinde kantilever ile sahneye yerleştirin. Ardından, AFM fotodiyotunun önüne küçük bir kağıt parçası yerleştirin. Kağıt üzerindeki nokta parlak ve odaklanmış olana kadar lazeri ayarlayın ve sonra kağıdı çıkarın.
Fotodiyottan gelen sinyali görüntülemek için AFM yazılımını başlatın. AFM kafa aynasını lazer sinyalinin dört fotodiyot çeyreğinde de maksimize edilebis ve üst ve alt dörtlü çiftleri arasında farklı bir sinyal sıfır olacak şekilde ayarlayın. AFM'yi kalibre etmeye başlamak için, AFM kafa sinyali için filtre ayarını tam bant genişliğine çevirin ve piezo'nun kapalı olduğundan emin olun.
AFM yazılımında, hesaplama başına 1,024 veri puanı yla güç spektrumunun ortalama 512 hesaplamasını ölçün. Güç spektral yoğunluğunu ilk tepeye entegre edin, bu da kantilin ana titreşim moduna karşılık gelir. Ardından, piezo denetleyicisini açın ve filtreyi 500 Hertz'e ayarlayın.
Farklı sinyali izlerken AFM kafasını birkaç yüz mikrometre aşağı doğru hızla hareket ettirin. Farklı sinyal tutarlı atlar izlerken bir seferde birkaç yüz mikrometre aşağı baş hareket devam edin. Sinyal atlayışları yüksekliği artmaya başladığında, uç örnek yüzeye çok yakındır.
Sapma sinyali yüzeyle uç teması nda doygunlaştığında, başı hafifçe kaldırın, ardından örnek yüzeyi bulmak için AFM kafasını 100 ila 5 000 nanometre yukarı veya aşağı hareket ettirecek piezo gerilimini ayarlayın. Bundan sonra, uç yüzey, ya da piezo motor seyahat yaklaşık 100 nanometre temas böylece yaklaşık 500 nanometre bir tarayın bir çekme deneyi yapın. Yay sabitini ve hassasiyetini hesaplamak için sonuçları kullanın.
Yazılımda, tbmm boyutunu ortaya çıkan poliproteinin toplam teorik boyutundan %40 daha büyük olarak ayarlayın. Kantili, tazyim boyutunun %80'ini yüzeyden uzakta olacak şekilde yerleştirin. Tarayın hızını saniyede 300 nanometreye ayarlayın.
Bir çekme deneyi gerçekleştirin ve elde edilen piezo konumunu ve fotodiyot sinyalini ölçün. Numunenin kurumasını engellemek için ölçüm boyunca sıvı hücresine saat başı deney arabelleği ekleyin. Bir I91 poliproteininin ve üç I91 etki alanının her iki taraftaki NI10C molekülünü kuşattığı bir poliproteinin kayıtlarında ortaya çıkan olaylar, solucan benzeri bir zincir modeliyle donatılmıştır.
Her iki kayıt da I91'in karakteristik kuvvetini ve kontur uzunluğu artışlarını göstererek AFM kalibrasyonunun başarılı olduğunu gösterir. N110C molekülünü içeren poliproteinkayıtları, yeni olayların ortaya çıkan ilgi proteininden geldiğini doğrulayacak kadar I91 olayı gösterdi. Ankyrin tekrarı için ortalama kontur uzunluğu yaklaşık 10.5 nanometre, ve açılma kuvvetleri sekiz ila 25 pikonewton arasındaydı.
Bir poliprotein kullanmak çok önemlidir çünkü yan proteinlerin gelişen olayları tek molekül olayını parmak izi için pozitif bir kontrol sağlar. Bu olmadan, veriler yanlış yorumlamaya karşı sorumludur.
