La spectroscopie de force à molécule unique peut fournir d’énormes informations sur la biologie moléculaire à l’échelle atomique en nous permettant de manipuler des molécules simples avec force. Ici, nous démontrons une mesure de vitesse constante à l’aide du microscope à force atomique. Nous pouvons en fin de compte utiliser les données pour déterminer la stabilité des protéines, le taux de déroulement et le déroulement de la voie.
Pour commencer la procédure, fixez un onglet adhésif non conductrice à un disque de fer propre de 15 millimètres de large. Retirez la feuille de couverture et appuyez fermement sur une glissière en verre propre, non encolée ou recouverte d’or sur l’adhésif exposé. Conservez la lame dans une boîte de Pétri propre et couverte.
Ensuite, concentrez la polyprotéine purifiée dans un filtre centrifuge, puis inversez la colonne et élitz la protéine dans le tampon à utiliser dans l’expérience. Déterminer la concentration de protéines appropriée en fonction de l’absorption à 280 nanomètres, puis préparer 100 microlitres d’une solution de 100 microgrammes par millilitre de la protéine. Appliquer une goutte de 60 microlitres de la solution protéique au centre de la lame.
Prenez soin de ne pas laisser le liquide glisser entre la lame et le disque de fer, car cela conduira à des mouvements d’échantillon incontrôlés pendant l’expérience. Laissez reposer l’échantillon à température ambiante pendant au moins 10 minutes. Tout d’abord, prenez soigneusement le porte-à-faux à la fin et placez-le dans la cellule de fixation de la sonde.
Assurez-vous que le porte-à-faux est fermement assis. Placez ensuite la cellule de détention dans la tête de l’AFM. Placez la tête sur un stade de microscope inversé et connectez un bloc-batterie à la tête de l’AFM pour alimenter le laser.
Installez une caméra pour le détecteur de microscope pour visualiser la lumière laser sur un moniteur ou un écran de télévision. Guidé par le microscope, placez le laser de sorte qu’il soit dirigé sur la pointe en porte-à-faux. Une fois l’échantillon prêt, rincer 10 microlitres du tampon d’expérience dans chaque port de la cellule de fixation de la sonde.
Décanter environ 40 microlitres de liquide de la glissière de l’échantillon et ajouter 40 microlitres de tampon. Entre-temps, commencer à préparer le microscope à force atomique pour la mesure. Tout d’abord, placez la glissière sur l’aimant au-dessus du moteur piezo.
Confirmez que l’étape de l’AFM est en position surélevée, puis placez la tête de l’AFM sur la scène avec le porte-à-faux au-dessus de la gouttelette de l’échantillon. Ensuite, placez un petit morceau de papier devant la photodiode de l’AFM. Réglez le laser jusqu’à ce que l’endroit sur le papier soit lumineux et concentré, puis retirez le papier.
Démarrez le logiciel AFM pour afficher le signal à partir de la photodiode. Ajustez le miroir de tête AFM de sorte que le signal laser soit maximisé dans les quatre quadrants photodiodes, et un signal différent entre les paires de quadrants supérieur et inférieur est nul. Pour commencer à calibrer l’AFM, tournez le réglage du filtre pour le signal de tête AFM à pleine bande passante, et assurez-vous que le piezo est éteint.
Dans le logiciel AFM, mesurez la moyenne de 512 calculs du spectre de puissance, avec 1024 points de données par calcul. Intégrer la densité spectrale de puissance à travers le premier pic, ce qui correspond au mode principal de vibration pour le porte-à-faux. Ensuite, allumez le contrôleur piezo et réglez le filtre à 500 Hertz.
Déplacez rapidement la tête de l’AFM vers le bas quelques centaines de micromètres tout en surveillant le signal différent. Continuez à déplacer la tête vers le bas quelques centaines de micromètres à la fois tout en regardant pour des sauts cohérents dans le signal différent. Lorsque le signal saute commencent à augmenter en hauteur, la pointe est très proche de la surface de l’échantillon.
Une fois que le signal de déflexion sature au contact de la pointe avec la surface, levez légèrement la tête, puis ajustez la tension piezo pour déplacer la tête de l’AFM vers le haut ou vers le bas de 100 à 5000 nanomètres pour trouver la surface de l’échantillon. Après cela, effectuer une expérience de traction avec une taille de balayage d’environ 500 nanomètres de sorte que la pointe entre en contact avec la surface, ou environ 100 nanomètres de voyage moteur piezo. Utilisez les résultats pour calculer la constante et la sensibilité du ressort.
Dans le logiciel, réglez la taille de l’analyse à 40% plus grande que la taille théorique totale de la polyprotéine qui se déroule. Placez le porte-à-faux de sorte qu’il soit 80% de la taille de balayage loin de la surface. Réglez la vitesse de balayage à 300 nanomètres par seconde.
Effectuez une expérience de traction et mesurez la position piezo qui en résulte et le signal photodiode. Ajoutez un tampon d’expérience à la cellule fluide toutes les heures tout au long de la mesure pour empêcher l’échantillon de se dessécher. Les événements qui se déroulent dans les enregistrements d’une polyprotéine I91 et d’une polyprotéine dans laquelle trois domaines I91 flanquaient la molécule NI10C de chaque côté, ont été équipés d’un modèle de chaîne en ressemble à un ver.
Les deux enregistrements montrent la force caractéristique et les incréments de longueur de contour de i91, indiquant que l’étalonnage d’AFM a été réussi. Les enregistrements de la polyprotéine contenant la molécule N110C ont montré suffisamment d’événements I91 pour confirmer que les nouveaux événements étaient de la protéine d’intérêt qui se déroulait. La longueur moyenne de contour pour la répétition d’ankyrine était d’environ 10,5 nanomètres, et les forces de déroulement étaient entre huit et 25 piconewtons.
Il est essentiel d’utiliser une polyprotéine parce que les événements qui se déroulent des protéines flanquantes fournissent un contrôle positif à l’empreinte digitale de l’événement molécule unique. Sans cela, les données sont susceptibles d’être mal interprétées.
