Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie kann enorme Einblicke in die Molekularbiologie auf der atomaren Skala liefern, indem sie es uns ermöglicht, einzelne Moleküle mit Kraft zu manipulieren. Hier zeigen wir eine konstante Geschwindigkeitsmessung mit Dematomkraftmikroskop. Letztendlich können wir die Daten verwenden, um die Proteinstabilität, die Entfaltungsrate und den Entfaltungsweg zu bestimmen.
Um das Verfahren zu beginnen, befestigen Sie eine nichtleitende Klebelabe an einer sauberen, 15 Millimeter breiten Eisenscheibe. Entfernen Sie die Deckblattund drücken Sie fest einen sauberen, unbeschichteten oder vergoldeten Glasschlitten auf den exponierten Klebstoff. Bewahren Sie die Rutsche in einer sauberen, bedeckten Petrischale auf.
Als nächstes konzentrieren Sie das gereinigte Polyprotein in einem Zentrifugalfilter, kehren Sie dann die Säule um und werden das Protein in den Puffer, der im Experiment verwendet werden soll, ausgedünnt. Bestimmen Sie die geeignete Proteinkonzentration auf der Grundlage der Absorption von 280 Nanometern und bereiten Sie dann 100 Mikroliter einer 100 Mikrogramm pro Milliliter Lösung des Proteins zu. Tragen Sie einen 60-Mikroliter-Tropfen der Proteinlösung auf die Mitte des Dias auf.
Achten Sie darauf, dass die Flüssigkeit nicht zwischen dem Schlitten und der Eisenscheibe gleiten lässt, da dies während des Experiments zu unkontrollierten Probenbewegungen führt. Lassen Sie die Probe mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen. Nehmen Sie zunächst den Ausleger vorsichtig am Ende auf und legen Sie ihn in die Sondenhaltezelle.
Stellen Sie sicher, dass der Ausleger fest sitzt. Legen Sie dann die Haltezelle in den AFM-Kopf. Stellen Sie den Kopf auf eine invertierte Mikroskopstufe und schließen Sie einen Akku an den AFM-Kopf an, um den Laser mit Strom zu versorgen.
Richten Sie eine Kamera für den Mikroskopdetektor ein, um das Laserlicht auf einem Monitor oder Fernsehbildschirm zu visualisieren. Durch das Mikroskop geführt, positionieren Sie den Laser so, dass er auf die Auslegerspitze gerichtet ist. Sobald die Probe fertig ist, spülen Sie 10 Mikroliter des Experimentpuffers in jeden Port der Sondenhaltezelle.
Decant ca. 40 Mikroliter Flüssigkeit aus dem Probenschlitten und fügen 40 Mikroliter Puffer hinzu. In der Zwischenzeit beginnen Sie mit der Vorbereitung des Atomkraftmikroskops für die Messung. Platzieren Sie zunächst die Rutsche auf dem Magneten über dem Piezomotor.
Bestätigen Sie, dass sich die AFM-Stufe in erhöhter Position befindet, und platzieren Sie dann den AFM-Kopf mit dem Ausleger über dem Sample-Tröpfchen auf der Bühne. Als nächstes legen Sie ein kleines Stück Papier vor die AFM-Fotodiode. Passen Sie den Laser so lange an, bis die Stelle auf dem Papier hell und fokussiert ist, und entfernen Sie dann das Papier.
Starten Sie die AFM-Software, um das Signal von der Photodiode anzuzeigen. Stellen Sie den AFM-Kopfspiegel so ein, dass das Lasersignal in allen vier Photodioden-Quadranten maximiert wird und ein anderes Signal zwischen den oberen und unteren Quadrantenpaaren Null ist. Um mit der Kalibrierung des AFM zu beginnen, drehen Sie die Filtereinstellung für das AFM-Kopfsignal auf volle Bandbreite, und stellen Sie sicher, dass der Piezo ausgeschaltet ist.
Messen Sie in der AFM-Software den Durchschnitt von 512 Berechnungen des Leistungsspektrums mit 1 024 Datenpunkten pro Berechnung. Integrieren Sie die Leistungsspektraldichte über den ersten Peak, der dem Hauptschwingungsmodus für den Ausleger entspricht. Schalten Sie als Nächstes den Piezo-Controller ein und stellen Sie den Filter auf 500 Hertz ein.
Bewegen Sie den AFM-Kopf schnell ein paar hundert Mikrometer nach unten, während Sie das unterschiedliche Signal überwachen. Bewegen Sie den Kopf ein paar hundert Mikrometer auf einen Zeitnachdem, während Sie auf konsistente Sprünge im verschiedenen Signal achten. Wenn die Signalsprünge in der Höhe zu steigen beginnen, ist die Spitze sehr nah an der Probenoberfläche.
Sobald das Ablenksignal bei Spitzenkontakt mit der Oberfläche gesättigt ist, heben Sie den Kopf leicht an, und passen Sie dann die Piezospannung an, um den AFM-Kopf um 100 bis 5 000 Nanometer nach oben oder unten zu bewegen, um die Probenoberfläche zu finden. Danach führen Sie ein Ziehen Experiment mit einer Scangröße von etwa 500 Nanometern durch, so dass die Spitze die Oberfläche kontaktiert, oder etwa 100 Nanometer Piezomotorfahren. Verwenden Sie die Ergebnisse, um die Federkonstante und Empfindlichkeit zu berechnen.
Legen Sie in der Software die Scangröße auf 40 % größer als die theoretische Gesamtgröße des sich entfaltenden Polyproteins fest. Positionieren Sie den Ausleger so, dass er 80 % der Scangröße von der Oberfläche entfernt ist. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 300 Nanometer pro Sekunde ein.
Führen Sie ein Ziehen experimentierstehen und messen Sie die resultierende Piezoposition und das Photodiodensignal. Fügen Sie der Flüssigkeitszelle während der gesamten Messung stündlich einen Experimentpuffer hinzu, um das Austrocknen der Probe zu verhindern. Die sich entfaltenden Ereignisse bei Aufnahmen eines I91-Polyproteins und eines Polyproteins, bei denen drei I91-Domänen das NI10C-Molekül auf jeder Seite flankierten, wurden mit einem wurmartigen Kettenmodell ausgestattet.
Beide Aufnahmen zeigen die charakteristischen Kraft- und Konturlängenschritte von I91, was darauf hindeutet, dass die AFM-Kalibrierung erfolgreich war. Die Aufnahmen des Polyproteins, das das N110C-Molekül enthielt, zeigten genügend I91-Ereignisse, um zu bestätigen, dass die neuen Ereignisse aus dem Protein von Interesse stammten. Die mittlere Konturlänge für die Ankyrin-Wiederholung betrug etwa 10,5 Nanometer, und die Entfaltungskräfte lagen zwischen acht und 25 Piconewtons.
Es ist wichtig, ein Polyprotein zu verwenden, da die sich entfaltenden Ereignisse der flankierenden Proteine eine positive Kontrolle bieten, um das einzelne Molekülereignis zu fingerprinten. Andernfalls können die Daten falsch interpretiert werden.
