単一分子力分光法は、単一分子を力で操作できるようにすることで、原子スケールで分子生物学に関する膨大な洞察を提供することができます。ここでは、原子間力顕微鏡を用いた一定速度測定を行う。最終的にデータを使用して、タンパク質の安定性、展開速度、展開経路を決定することができます。
手順を開始するには、非導電性接着剤タブをクリーンな15ミリメートル幅の鉄ディスクに取り付けます。カバーシートを取り外し、露出した接着剤に清潔でコーティングされていない、または金でコーティングされたガラススライドをしっかりと押し込みます。スライドを清潔で覆われたペトリ皿に保管します。
次に、精製したポリタンパク質を遠心フィルターに濃縮し、次にカラムを逆にして、実験に使用するバッファーにタンパク質を溶出させる。280ナノメートルの吸光度に基づいて適切なタンパク質濃度を決定し、次いでタンパク質の1ミリリットル溶液あたり100マイクログラムの100マイクロリットルを調製する。60マイクロリットルのタンパク質溶液をスライドの中央に塗布します。
これは、実験中に制御されていないサンプルの動きにつながるので、スライドと鉄ディスクの間に液体が滑らせないように注意してください。サンプルを室温で少なくとも10分間座らせます。まず、末端でカンチレバーを慎重にピックアップし、プローブ保持セルに入れる。
片持ちレバーがしっかりと取り付けられていることを確認します。次に、AFMヘッドに保持セルを置きます。逆顕微鏡ステージにヘッドをセットし、電池パックをAFMヘッドに接続してレーザーに電力を供給します。
顕微鏡検出器用のカメラを設置し、モニタやテレビ画面でレーザー光を可視化します。顕微鏡で導き、レーザーをカンチレバー先端に向けられるように位置する。サンプルの準備ができたら、10マイクロリットルの実験バッファーをプローブ保持セルの各ポートにフラッシュします。
サンプルスライドから約40マイクロリットルの流体をデスキャンし、40マイクロリットルのバッファーを追加します。その間、測定のための原子間力顕微鏡の準備を始める。まず、マグネット上のピエゾモーターの上にスライドを置きます。
AFMステージが高い位置にあることを確認し、サンプル液滴の上に片持ち持ちでステージ上にAFMヘッドを置きます。次に、AFMフォトダイオードの前に小さな紙を置きます。用紙のスポットが明るくなり、焦点が合うまでレーザーを調整し、用紙を取り外します。
AFMソフトウェアを起動して、フォトダイオードからの信号を表示します。4 つのフォトダイオード象限でレーザー信号が最大になり、上部と下部の象限ペアの間の異なる信号がゼロになるように、AFM ヘッド ミラーを調整します。AFM のキャリブレーションを開始するには、AFM ヘッド信号のフィルタ設定を全帯域幅に切り、ピエゾがオフになっていることを確認します。
AFM ソフトウェアでは、1 つの計算で 1,024 データポイントを使用して、パワースペクトルの 512 の計算の平均を測定します。カンチレバーの振動のメインモードに対応する第1のピークを横切って電力スペクトル密度を統合します。次に、圧電コントローラをオンにして、フィルタを500ヘルツに設定します。
AFMヘッドを数百マイクロメートル下に素早く移動させながら、異なる信号を監視します。異なる信号で一貫したジャンプを見ながら、一度に数百マイクロメートル下に頭を動かし続けます。信号のジャンプが高さが増加し始めると、先端はサンプル表面に非常に近くなります。
表面との先端接触時に偏向信号が飽和したら、ヘッドをわずかに上げてから、ピエゾ電圧を調整してAFMヘッドを100~5,000ナノメートル動かしてサンプル表面を見つけます。その後、約500ナノメートルのスキャンサイズで、先端が表面に接触するように、または約100ナノメートルのピエゾモーター移動で、引っ張り実験を行います。結果を使用して、ばね定数と感度を計算します。
ソフトウェアでは、スキャンサイズを展開するポリタンパク質の理論上の合計サイズよりも40%大きく設定します。表面からスキャンサイズの80%になるように片持ち面を配置します。スキャン速度を毎秒 300 ナノメートルに設定します。
引っ張り実験を行い、得られたピエゾ位置とフォトダイオード信号を測定します。測定全体を通して1時間ごとに実験バッファーを流体細胞に追加して、サンプルが乾燥しないようにします。I91ポリタンパク質の記録における展開イベントと、3つのI91ドメインがNI10C分子を両側に横たわっているポリタンパク質の、ワーム様鎖モデルを取り付けた。
両方の記録は、I91の特性力と輪郭の長さの増分を示し、AFMキャリブレーションが成功したことを示す。N110C分子を含むポリタンパク質の記録は、新しい事象が展開する目的のタンパク質からのものであることを確認するのに十分なI91事象を示した。アンキリン反復の平均輪郭長は約10.5ナノメートルで、展開力は8~25ピコニュートンの間であった。
隣接するタンパク質の展開イベントは、単一分子イベントをフィンガープリントする肯定的なコントロールを提供するので、ポリタンパク質を使用することが不可欠です。これがなければ、データは誤解を受けやすい。
