La spettroscopia di forza a singola molecola può fornire enormi intuizioni sulla biologia molecolare su scala atomica permettendoci di manipolare singole molecole con la forza. Qui, dimostriamo una misurazione della velocità costante usando il microscopio a forza atomica. Alla fine possiamo usare i dati per determinare la stabilità proteica, il tasso di spiegamento e il percorso di dispiegamento.
Per iniziare la procedura, collegare una linguetta adesiva non conduttiva a un disco di ferro pulito largo 15 millimetri. Rimuovere il foglio di copertura e premere con fermezza uno scivolo di vetro pulito, non rivestito o rivestito in oro sull'adesivo esposto. Conservare lo scivolo in una piastra di Petri pulita e coperta.
Quindi, concentrare la poliproteina purificata in un filtro centrifugo, quindi invertire la colonna ed elutare la proteina nel tampone da utilizzare nell'esperimento. Determinare la concentrazione proteica appropriata in base all'assorbanza a 280 nanometri, quindi preparare 100 microlitri di una soluzione di 100 microgrammi per millilitro della proteina. Applicare una goccia di 60 microliter della soluzione proteica al centro dello scivolo.
Fare attenzione a non lasciare che il liquido scivoli tra lo scivolo e il disco di ferro, in quanto ciò porterà a movimenti incontrollati del campione durante l'esperimento. Lasciare riposare il campione a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. In primo luogo, raccogliere attentamente il sbalzino entro la fine e posizionarlo nella cella di tenuta della sonda.
Assicurarsi che il cantilever sia saldamente seduto. Quindi posizionare la cella di tenuta nella testa AFM. Impostare la testa su uno stadio di microscopio invertito e collegare un pacco batteria alla testa AFM per alimentare il laser.
Impostare una fotocamera per il rilevatore di microscopio per visualizzare la luce laser su un monitor o uno schermo TV. Guidati dal microscopio, posizionare il laser in modo che sia diretto sulla punta a sbalzi. Una volta che il campione è pronto, sciacquare 10 microlitri del buffer dell'esperimento in ogni porta della cella di attesa della sonda.
Decantare circa 40 microlitri di fluido dallo scivolo del campione e aggiungere 40 microlitri di tampone. Nel frattempo, inizia a preparare il microscopio a forza atomica per la misurazione. Per prima cosa, posizionare lo scivolo sul magnete sopra il motore piezo.
Verificare che lo stadio AFM sia in posizione elevata, quindi posizionare la testa AFM sul palco con il sbalzino sopra la goccia campione. Quindi, posizionare un piccolo pezzo di carta di fronte al fotodiodo AFM. Regolare il laser fino a quando il punto sulla carta è luminoso e focalizzato, quindi rimuovere la carta.
Avviare il software AFM per visualizzare il segnale dal fotodiodo. Regolare lo specchio della testa AFM in modo che il segnale laser sia massimizzato in tutti e quattro i quadranti fotodiodi e un segnale diverso tra le coppie di quadranti superiore e inferiore sia zero. Per iniziare a calibrare l'AFM, ruotare l'impostazione del filtro per il segnale della testa AFM a larghezza di banda completa e assicurarsi che il piezo sia spento.
Nel software AFM, misurare la media di 512 calcoli dello spettro di potenza, con 1.024 punti dati per calcolo. Integrare la densità spettrale di potenza attraverso il primo picco, che corrisponde alla principale modalità di vibrazione per il cantilever. Quindi, accendere il controller piezo e impostare il filtro su 500 Hertz.
Spostare rapidamente la testa AFM verso il basso di alcune centinaia di micrometri monitorando il diverso segnale. Continua a muovere la testa verso il basso di alcune centinaia di micrometri alla volta mentre guardi salti coerenti nel diverso segnale. Quando i salti del segnale iniziano ad aumentare in altezza, la punta è molto vicina alla superficie del campione.
Una volta che il segnale di deflessione si satura al contatto della punta con la superficie, sollevare leggermente la testa, quindi regolare la tensione piezo per spostare la testa AFM verso l'alto o verso il basso di 100-5.000 nanometri per trovare la superficie del campione. Successivamente, condurre un esperimento di trazione con una dimensione di scansione di circa 500 nanometri in modo che la punta contatti la superficie, o circa 100 nanometri di corsa del motore piezo. Utilizzare i risultati per calcolare la costante e la sensibilità della molla.
Nel software, impostare la dimensione della scansione su 40% più grande della dimensione teorica totale della poliproteina in corso. Posizionare il sbalzino in modo che sia l'80% della dimensione della scansione lontano dalla superficie. Impostare la velocità di scansione su 300 nanometri al secondo.
Eseguire un esperimento di trazione e misurare la posizione del piezo risultante e il segnale del fotodiodo. Aggiungere il buffer dell'esperimento alla cella del fluido ogni ora durante la misurazione per evitare che il campione si asciughi. Gli eventi in corso nelle registrazioni di una poliproteina I91 e di una poliproteina in cui tre domini I91 fiancheggiavano la molecola NI10C su ciascun lato, erano dotati di un modello a catena simile a un verme.
Entrambe le registrazioni mostrano gli incrementi caratteristici della forza e della lunghezza del contorno di I91, indicando che la calibrazione AFM ha avuto successo. Le registrazioni della poliproteina contenente la molecola N110C mostrarono abbastanza eventi I91 da confermare che i nuovi eventi provengono dalla proteina di interesse che si svolge. La lunghezza media del contorno per la ripetizione dell'anchirina era di circa 10,5 nanometri, e le forze dispiegate erano tra gli otto e i 25 piconewton.
È essenziale usare una poliproteina perché gli eventi di dispiegamento delle proteine di fianco forniscono un controllo positivo per rilevare l'impronta digitale dell'evento della singola molecola. In caso di ciò, i dati sono suscettibili di interpretazione errata.
