La espectroscopia de fuerza de una sola molécula puede proporcionar enormes conocimientos sobre la biología molecular a escala atómica al permitirnos manipular moléculas individuales con fuerza. Aquí, demostramos una medición de velocidad constante usando el microscopio de fuerza atómica. En última instancia, podemos utilizar los datos para determinar la estabilidad de la proteína, la velocidad de desdoblamiento y la vía de desdoblamiento.
Para comenzar el procedimiento, conecte una pestaña adhesiva no conductora a un disco de hierro limpio de 15 milímetros de ancho. Retire la hoja de la cubierta y presione firmemente una diapositiva de vidrio limpia, sin recubrimiento o recubierta de oro sobre el adhesivo expuesto. Guarde el portaobjetos en un plato limpio y cubierto de Petri.
A continuación, concentre la poliproteína purificada en un filtro centrífugo, luego invierta la columna y eluda la proteína en el tampón que se utilizará en el experimento. Determinar la concentración de proteína adecuada basada en la absorbancia a 280 nanómetros, y luego preparar 100 microlitros de una solución de 100 microgramos por mililitro de la proteína. Aplicar una gota de 60 microlitros de la solución proteica en el centro de la diapositiva.
Tenga cuidado de no dejar que el líquido se deslice entre la diapositiva y el disco de hierro, ya que esto conducirá a movimientos de muestra incontrolados durante el experimento. Deje reposar la muestra a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. En primer lugar, recoja cuidadosamente el voladizo por el extremo y colóquelo en la celda de retención de la sonda.
Asegúrese de que el voladizo esté firmemente asentado. A continuación, coloque la celda de retención en la cabeza de AFM. Ponga la cabeza en una etapa de microscopio invertido y conecte una batería a la cabeza AFM para alimentar el láser.
Configure una cámara para el detector de microscopios para visualizar la luz láser en un monitor o pantalla de TV. Guiado por el microscopio, coloque el láser de modo que se dirija a la punta del voladizo. Una vez que la muestra esté lista, enjuague 10 microlitros del búfer del experimento en cada puerto de la célula de retención de la sonda.
Decantar aproximadamente 40 microlitros de líquido de la diapositiva de la muestra y añadir 40 microlitros de tampón. Mientras tanto, comience a preparar el microscopio de fuerza atómica para la medición. En primer lugar, coloque la diapositiva sobre el imán por encima del motor piezoeléctrico.
Confirme que la etapa AFM está en la posición elevada, luego coloque la cabeza AFM en el escenario con el voladizo por encima de la gota de muestra. A continuación, coloque un pequeño trozo de papel delante del fotodiodo AFM. Ajuste el láser hasta que el punto del papel esté brillante y enfocado, y luego retire el papel.
Inicie el software AFM para ver la señal del fotodiodo. Ajuste el espejo de cabeza AFM para que la señal láser se maximice en los cuatro cuadrantes de fotodiodos, y una señal diferente entre los pares del cuadrante superior e inferior sea cero. Para comenzar a calibrar el AFM, gire la configuración del filtro para la señal de cabeza AFM a ancho de banda completo y asegúrese de que el piezo esté apagado.
En el software AFM, mida el promedio de 512 cálculos del espectro de potencia, con 1.024 puntos de datos por cálculo. Integre la densidad espectral de potencia a través del primer pico, que corresponde al modo principal de vibración para el voladizo. A continuación, encienda el controlador piezoeléctrico y ajuste el filtro a 500 Hertz.
Mueva rápidamente la cabeza AFM hacia abajo unos cientos de micrómetros mientras monitorea la señal diferente. Continúe moviendo la cabeza hacia abajo unos cientos de micrómetros a la vez mientras observa saltos consistentes en la señal diferente. Cuando los saltos de señal comienzan a aumentar en altura, la punta está muy cerca de la superficie de la muestra.
Una vez que la señal de desviación se satura al entrar en contacto con la punta con la superficie, levante ligeramente la cabeza y, a continuación, ajuste la tensión piezoeléctrica para mover la cabeza AFM hacia arriba o hacia abajo en 100 a 5.000 nanómetros para encontrar la superficie de la muestra. Después de eso, llevar a cabo un experimento de tracción con un tamaño de escaneo de unos 500 nanómetros para que la punta entre en contacto con la superficie, o alrededor de 100 nanómetros de viaje del motor piezo. Utilice los resultados para calcular la constante y la sensibilidad del muelle.
En el software, establezca el tamaño de escaneado en 40% mayor que el tamaño teórico total de la poliproteína que se despliega. Coloque el voladizo de modo que esté al 80% del tamaño del escaneo lejos de la superficie. Establezca la velocidad de escaneo en 300 nanómetros por segundo.
Realizar un experimento de tracción y medir la posición piezoeléctrica resultante y la señal de fotodiodo. Agregue el tampón del experimento a la célula de fluido cada hora durante toda la medición para evitar que la muestra se seque. Los eventos de desarrollo en las grabaciones de una poliproteína I91 y de una poliproteína en la que tres dominios I91 flanqueaban la molécula NI10C a cada lado, estaban equipados con un modelo de cadena similar a un gusano.
Ambas grabaciones muestran los incrementos característicos de fuerza y longitud de contorno de I91, lo que indica que la calibración de AFM se realizó correctamente. Las grabaciones de la poliproteína que contiene la molécula N110C mostraron suficientes eventos I91 para confirmar que los nuevos eventos eran de la proteína de interés que se desarrollaba. La longitud media del contorno para la repetición de la anquirina fue de unos 10,5 nanómetros, y las fuerzas de desdoblamiento estaban entre ocho y 25 piconewtons.
Es esencial utilizar una poliproteína porque los eventos de desarrollo de las proteínas que flanquean proporcionan un control positivo para tomar huellas dactilares del evento de molécula única. Sin esto, los datos pueden ser objeto de una interpretación errónea.
