Bu protokol, uyanık veya nispeten anestezi uygulanmış bir hayvanda beynin herhangi bir derinliğindeki nöral yapılardan birkaç saat boyunca in vivo olarak eşzamanlı görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar gerçekleştirmek için konfokal lazer taramalı fiber optik endomikroskobu kullanmamıza izin verdi. Daha önce elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılanlara benzer bir yöntem kullanarak uyanık hayvanlarda derin beyin görüntülemesine izin veren ağrısız bir kısıtlama yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, epilepsi ve yaşa bağlı makula dejenerasyonunun kemirgen modellerinde fonksiyonel vasküler anormallikleri incelemek için kullanılmıştır.
Kan akımı patolojisinin hastalıkların çoğu organında olmasa da çoğunda katkısını değerlendirmek için uygun bir tekniktir. Bu teknik, beyindeki kan akış dinamiklerinin gerçek zamanlı bir çalışması için geliştirilmiş olsa da, in vivo retinadaki kan akışını incelemek için kullandık. Sinir dokusundaki vasküler çalışmalarla sınırlı değildir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan yüksek nitelikli bir teknisyen olan Jose Maria Gonzalez Martin olacak. Petal reflekse yanıt eksikliğini onayladıktan sonra, dişleri ısırma çubuğunun deliğine yerleştirin ve farenin kafasını kemirgen stereotaksik bir çerçevede sabitleyin. Burun kelepçesini tam oturana kadar sıkın.
Vücudun pozisyonu mümkün olduğunca düz olmalıdır. Kafatasını, kafatasının elmacık süreçleri kelepçenin içinde olacak şekilde sabitlemek için çene tutucu manşetli kulak çubukları kullanın. Saç derisini temizledikten ve sterilize ettikten sonra, kafatasının tabanından kafatasının sagital orta hattı boyunca gözlerin arasına kadar orta hat boyunca 12 ila 15 milimetre kesi yapın ve kafa derisinin sınırlarını geri çekmek, kafatasını açığa çıkarmak ve çalışma alanını en üst düzeye çıkarmak için dört adet 28 milimetre Bulldog serrefine kelepçesi kullanın.
Periosteumu insizyonun kenarlarına kazıyın ve kafatasının üstünü kurutun. Kafatasının yüksekliğini, bregmanın arkasındaki herhangi bir mesafede ve kafatasının her iki tarafında orta hattan iki eşit mesafede ölçün. Stereotaksik atlas yardımıyla hedef noktayı, sağ hipokampusu belirleyin.
Kafatasında, stereotax ile bregma'ya göre hedef nokta koordinatlarını bulun ve doğrudan hipokampusun üzerindeki hedef noktanın etrafında ortalanmış 1.4 x iki milimetrelik bir görüntüleme penceresinin dört köşesini işaretlemek için cerrahi bir işaretleyici kullanın. Sol üst parietal kemiğin üzerine ek bir işaret ve kemik vidaları için sağ ön kemiğin üzerine başka bir işaret çizmek için cerrahi işaretleyiciyi kullanın. Epidural EEG kayıt elektrot yerleştirme noktalarını belirtmek için orta hattın her iki tarafına birer milimetre ve orta hatta lambdanın bir milimetre arkasına bir nokta çizmek için işaretleyiciyi kullanın.
Baş kapağını takmak için, bir diş matkabını 0,7 milimetre çapında çapakla donatın ve kafatasında kemik vidası yerleştirme noktalarında dikkatlice iki küçük delik açın. Ardından, vida uçlarının kemiğin altından kafatası boşluğuna çıkmamasına dikkat ederek, her deliğe %70 ila 80 etanol sterilize edilmiş dört milimetre 0.85 çapında paslanmaz çelik oluklu kemik vidası yerleştirin. Ardından, kafa başlığını orta hat boyunca bregmanın üzerindeki ön çıkıntı ile hizalamak için stereotaksik cihaza monte edilmiş mikro sürücüye kenetlenmiş L şeklinde bir özel hizalama parçası kullanın ve kafatasına çok fazla baskı uygulamamaya dikkat ederek vidalar kafatası üzerinde düz durana kadar bregmanın üzerine iki Fillister başlı oluklu tahrik vidası yerleştirin.
Görüntüleme penceresini kurmak için, 1,4 x iki milimetre kraniyotomi penceresinin çevresini yinelemeli olarak daha derin kesiklerle nazikçe tanımlamak için matkabı kullanmadan önce, görüntüleme penceresinin köşeleri için kraniyotomi referans işaretlerinin konumlarının her birine 0,7 milimetre çapında bir çapak deliği açın. Açık pencereyi kemik mumu ile kapatın ve epidural EEG elektrot deliklerini delmek için 0,9 milimetre çapında bir çapak kullanın, duramateri kesmemeye dikkat edin. Üç deliği kemik mumu ile örtün ve duvarı kafa kapağına bağlamak için görüntüleme penceresini ve EEG deliklerini kapsayan bir diş çimentosu duvarı oluşturun.
Çimento kuruduğunda, gevşek yara kenarlarını kapatmak için 4.0 veya 5.0 siyah örgülü ipek ve basit kesintili dikişler kullanın ve açıkta kalan cilde lidokain ve antibakteriyel merhemler uygulamak için pamuk uçlu bir aplikatör kullanın. Ardından fareyi tamamen iyileşene kadar izlemeli sıcak bir kafese yerleştirin. Kafa kapağı implantasyon anketinden bir gün sonra, görüntüleme seansı boyunca uyanık fareyi çerçeveye güvenli bir şekilde konumlandırmak için kafa kapağını stereotaksik çerçeveye bağlı özel bir montaj çubuğuna sabitleyin.
Toprak epidural EEG kayıt elektrotlarını arka merkezi deliğe yerleştirin ve kayıt elektrotlarını ön sol ve sağ deliklere yerleştirin. Tellerin uçları L şeklindedir ve kafatası ile duramater arasına yerleştirilmiştir. Hipokampus içindeki kan akışını görselleştirmek için, merkezi damarı bulmak için kuyruğu iki parmağınızla sabitleyin ve kuyruğa paralel entegre 30 gauge iğne ile donatılmış ultra ince bir insülin şırıngasını tutarak, iğne eğimli tarafını damarın içine yaklaşık yarıya kadar sokun 200 mikrolitre% 5 yeşil floresein lizin ile sabitlenebilir dekstran vermek için kuyruğun tabanından yaklaşık yarıya ila üçte ikisi.
Ardından, durayı çıkarmak ve konfokal lazer tarama kaydını başlatmak için bir şırınga iğnesinin bükülmüş ucunu kullanın. Kuyruk damarı enjeksiyonunun hemen ardından, 300 mikron eğimli fiber optik demeti robotik stereotaksik sürücünün mobil koluna aşağı yönde kelepçeleyin. Kısıtlama sistemi, kılcal damarlar ve proksimal duvar hücreleri de dahil olmak üzere derin beyin mikro damarlarının uzun saatler boyunca stabil kan akışı kayıtlarına izin verir.
Tüm mikrodamarların bu temsili analizinde, etiketli duvar hücrelerinde kan akışı durmaları meydana geldi. Fiber kayıtların miktarı, kan akışının yüksek çözünürlüklü iki foton görüntüleme kaydının kortikal doku içindeki eşdeğer vazospazmlarla karşılaştırılmasıyla belirlenebilir. Kayıt bölgelerindeki immünohistokimyasal analiz, hipokampal duvar hücrelerinin bu yöntem kullanılarak doğru bir şekilde hedeflendiğini, sadece tedaviye yanıt olarak daralmakla kalmayıp, aynı zamanda arteriyellerden uzaktaki mikro damarlardaki darlıklarla uzamsal olarak ilişkili olduğunu göstermektedir.
Bu protokolün uygulanabilmesi için stereotaksik cerrahi ve lateral kuyruk ven enjeksiyonunda yeterlilik çok önemlidir. Hatayı azaltmak ve doğruluğu artırmak için kapsamlı uygulama şarttır. Teknik, derin beyin yapılarındaki kan akış dinamiklerinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine izin vererek, vasküler sistem patolojilerini incelemek ve bunları hedef alan tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için uygun hale getirir.
