Este protocolo nos permitió utilizar el endomicroscopio de fibra óptica de barrido láser confocal para realizar imágenes simultáneas y registros electrofisiológicos in vivo durante varias horas a partir de estructuras neuronales a cualquier profundidad del cerebro en el animal despierto o relativamente anestesiado. Desarrollamos un método de sujeción indoloro que permite obtener imágenes cerebrales profundas en animales despiertos utilizando un método similar a los empleados anteriormente para los registros electrofisiológicos. Este método se ha utilizado para estudiar anomalías vasculares funcionales en modelos de epilepsia y degeneración macular relacionada con la edad en roedores.
Es una técnica viable para evaluar la contribución de la patología del flujo sanguíneo en muchos, si no en la mayoría de los órganos de las enfermedades. Si bien esta técnica se desarrolló para un estudio en tiempo real de la dinámica del flujo sanguíneo en el cerebro, la hemos utilizado para estudiar el flujo sanguíneo en la retina in vivo. No se limita a los estudios vasculares en el tejido neural.
La demostración del procedimiento estará a cargo de José María González Martín, un técnico altamente cualificado de mi laboratorio. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo pétalo, coloque los dientes dentro del orificio de la barra de mordida y estabilice la cabeza del ratón en un marco estereotáxico de roedores. Apriete la abrazadera nasal hasta que quede ajustada.
La posición del cuerpo debe ser lo más recta posible. Use barras para los oídos con manguitos de soporte de mandíbula para asegurar la cabeza de modo que los procesos cigomáticos del cráneo estén dentro de la abrazadera. Después de limpiar y esterilizar el cuero cabelludo, haga una incisión de 12 a 15 milímetros a lo largo de la línea media desde la base del cráneo hasta entre los ojos a lo largo de la línea media sagital del cráneo, y use cuatro pinzas Bulldog serrefine de 28 milímetros para retraer los bordes del cuero cabelludo, exponiendo el cráneo y maximizando el área de trabajo.
Raspe el periostio hasta los bordes de la incisión y seque la parte superior del cráneo. Mide la altura del cráneo a cualquier distancia posterior al bregma, y dos distancias iguales laterales desde la línea media a cada lado del cráneo. Identifique el punto objetivo, el hipocampo derecho, con la ayuda de un atlas estereotáxico.
En el cráneo, encuentre las coordenadas del punto objetivo en relación con el bregma con la estereotaxia y use un marcador quirúrgico para marcar cuatro esquinas de una ventana de imágenes de 1,4 por dos milímetros centrada alrededor del punto objetivo directamente sobre el hipocampo. Use el marcador quirúrgico para dibujar una marca adicional sobre el hueso parietal superior izquierdo y otra sobre el hueso frontal derecho para los tornillos óseos. Use el marcador para dibujar un milímetro a cada lado de la línea media y un punto en la línea media un milímetro detrás de lambda para indicar los puntos de inserción del electrodo de registro de EEG epidural.
Para instalar la tapa de la cabeza, equipe un taladro dental con una fresa de 0,7 milímetros de diámetro y taladre con cuidado dos pequeños orificios en el cráneo en los puntos de colocación del tornillo óseo. A continuación, coloque un tornillo de hueso ranurado de acero inoxidable de 4 milímetros de diámetro de 0,85 de diámetro esterilizado con etanol de 70 a 80% en cada orificio, teniendo cuidado de que las puntas de los tornillos no sobresalgan más allá de la parte inferior del hueso hacia la cavidad del cráneo. A continuación, utilice una pieza de alineación personalizada en forma de L sujeta al micromotor montado en el dispositivo estereotáxico para alinear la tapa de la cabeza a lo largo de la línea media con la cresta anterior que recubre el bregma e inserte dos tornillos de accionamiento ranurados de cabeza Fillister sobre el bregma hasta que los tornillos queden planos sobre el cráneo, teniendo cuidado de no ejercer demasiada presión sobre el cráneo.
Para configurar la ventana de imágenes, taladre un orificio de rebaba de 0,7 milímetros de diámetro en cada una de las posiciones de las marcas de referencia de craneotomía para las esquinas de la ventana de imágenes antes de usar el taladro para delinear suavemente la periferia de la ventana de craneotomía de 1,4 por dos milímetros con cortes iterativamente más profundos. Cubra la ventana abierta con cera para huesos y use una fresa de 0,9 milímetros de diámetro para perforar los orificios del electrodo de EEG epidural, teniendo cuidado de no cortar la duramadre. Cubra los tres orificios con cera ósea y construya una pared de cemento dental que abarque la ventana de imágenes y los orificios del EEG para unir la pared a la tapa de la cabeza.
Cuando el cemento se haya secado, use seda trenzada negra 4.0 o 5.0 y suturas interrumpidas simples para cerrar los márgenes sueltos de la herida, y use un aplicador con punta de algodón para aplicar lidocaína y ungüentos antibacterianos sobre la piel expuesta. A continuación, coloque el ratón en una jaula caliente con supervisión hasta su completa recuperación. Un día después de la inspección de implantación de la tapa de la cabeza, asegure la tapa de la cabeza a una barra de montaje personalizada unida al marco estereotáxico para colocar el mouse despierto de forma segura en el marco durante toda la sesión de imágenes.
Inserte los electrodos de registro de EEG epidural molido en el orificio central posterior e inserte los electrodos de registro en los orificios anterior izquierdo y derecho. Las puntas de los alambres tienen forma de L y se colocan entre el cráneo y la duramadre. Para visualizar el flujo sanguíneo dentro del hipocampo, asegure la cola con dos dedos para ubicar la vena central y, sosteniendo una jeringa de insulina ultrafina equipada con una aguja integrada de calibre 30 paralela a la cola, inserte el lado biselado de la aguja hacia arriba en la vena aproximadamente a la mitad o dos tercios de la base de la cola para administrar 200 microlitros de dextrano fijable en lisina fluoresceína verde al 5%.
A continuación, utilice la punta doblada de una aguja de jeringa para extraer la duramadre e iniciar la grabación del escaneo láser confocal. Inmediatamente después de la inyección de la vena de cola, sujete el haz de fibra óptica biselado de 300 micras al brazo móvil del accionamiento estereotáxico robótico en una orientación hacia abajo. El sistema de sujeción permite registros estables del flujo sanguíneo de los microvasos cerebrales profundos, incluidos los capilares y sus células murales proximales durante largas horas.
En este análisis representativo de microvasos completos, se produjeron interrupciones del flujo sanguíneo en las células murales marcadas. La cantidad de registros de fibras se puede determinar comparando registros de imágenes de dos fotones de alta resolución del flujo sanguíneo con vasoespasmos equivalentes dentro del tejido cortical. El análisis inmunohistoquímico en los sitios de registro ilustra que las células murales del hipocampo se dirigen correctamente utilizando este método, no solo contrayéndose en respuesta al tratamiento, sino también asociándose espacialmente con estenosis en microvasos alejados de las arterias.
La competencia en la cirugía estereotáxica y la inyección lateral de la vena de la cola es crucial para realizar este protocolo. La práctica exhaustiva es esencial para reducir los errores y mejorar la precisión. La técnica permite obtener imágenes en tiempo real de la dinámica del flujo sanguíneo en estructuras cerebrales profundas, lo que la hace adecuada para estudiar patologías del sistema vascular y evaluar la eficacia de los tratamientos que se dirigen a ellas.
