Ce protocole nous a permis d’utiliser l’endomicroscope confocal à fibre optique à balayage laser pour effectuer simultanément des enregistrements d’imagerie et d’électrophysiologie in vivo pendant plusieurs heures à partir de structures neuronales à n’importe quelle profondeur du cerveau chez l’animal éveillé ou relativement anesthésié. Nous avons mis au point une méthode de contention indolore qui permet d’obtenir une imagerie cérébrale profonde chez les animaux éveillés en utilisant des méthodes similaires à celles utilisées précédemment pour les enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode a été utilisée pour étudier les anomalies vasculaires fonctionnelles dans des modèles d’épilepsie et de dégénérescence maculaire liée à l’âge chez les rongeurs.
C’est une technique viable pour évaluer la contribution de la pathologie du flux sanguin dans de nombreux organes, sinon la plupart des maladies. Bien que cette technique ait été développée pour une étude en temps réel de la dynamique du flux sanguin dans le cerveau, nous l’avons utilisée pour étudier le flux sanguin dans la rétine in vivo. Elle ne se limite pas aux études vasculaires dans le tissu neural.
La démonstration de la procédure sera faite par Jose Maria Gonzalez Martin, un technicien hautement qualifié de mon laboratoire. Après avoir confirmé l’absence de réponse au réflexe des pétales, placez les dents à l’intérieur du trou de la barre de morsure et stabilisez la tête de la souris dans un cadre stéréotaxique de rongeur. Serrez le serre-nez jusqu’à ce qu’il soit bien ajusté.
La position du corps doit être aussi droite que possible. Utilisez des embouts auriculaires avec des brassards de support de mâchoire pour fixer la tête de manière à ce que les processus zygomatiques du crâne soient à l’intérieur de la pince. Après avoir nettoyé et stérilisé le cuir chevelu, faites une incision de 12 à 15 millimètres le long de la ligne médiane de la base du crâne jusqu’entre les yeux le long de la ligne médiane sagittale du crâne et utilisez quatre pinces serrefine Bulldog de 28 millimètres pour rétracter les bords du cuir chevelu, exposant le crâne et maximisant la zone de travail.
Grattez le périoste jusqu’aux bords de l’incision et séchez le haut du crâne. Mesurez la hauteur du crâne à n’importe quelle distance postérieure au bregma, et à deux distances égales latérales de la ligne médiane de chaque côté du crâne. Identifiez le point cible, l’hippocampe droit à l’aide d’un atlas stéréotaxique.
Sur le crâne, trouvez les coordonnées du point cible par rapport au bregma avec la stéréotaxe, et utilisez un marqueur chirurgical pour marquer les quatre coins d’une fenêtre d’imagerie de 1,4 millimètre sur deux centrée autour du point cible directement au-dessus de l’hippocampe. Utilisez le marqueur chirurgical pour tracer une marque supplémentaire sur l’os pariétal supérieur gauche et une autre sur l’os frontal droit pour les vis osseuses. Utilisez le marqueur pour dessiner un millimètre de chaque côté de la ligne médiane et un point sur la ligne médiane un millimètre derrière lambda pour indiquer les points d’insertion de l’électrode d’enregistrement EEG péridurale.
Pour installer le capuchon de tête, équipez une perceuse dentaire d’une fraise de 0,7 millimètre de diamètre et percez soigneusement deux petits trous dans le crâne aux points de placement de la vis à os. Ensuite, placez une vis à os fendue en acier inoxydable de 0,85 de 0,85 diamètre stérilisée à l’éthanol de 70 à 80 % dans chaque trou, en veillant à ce que les pointes des vis ne dépassent pas du fond de l’os dans la cavité crânienne. Ensuite, utilisez une pièce d’alignement personnalisée en forme de L fixée au microvariateur monté sur le dispositif stéréotaxique pour aligner le capuchon de tête le long de la ligne médiane avec la crête antérieure recouvrant le bregma, et insérez deux vis d’entraînement à fente à tête fillister sur le bregma jusqu’à ce que les vis reposent à plat sur le crâne, en prenant soin de ne pas exercer trop de pression sur le crâne.
Pour configurer la fenêtre d’imagerie, percez un trou de bavure de 0,7 millimètre de diamètre à chacune des positions des marques de référence de craniotomie pour les coins de la fenêtre d’imagerie avant d’utiliser la perceuse pour délimiter doucement la périphérie de la fenêtre de craniotomie de 1,4 millimètre sur deux millimètres avec des coupes itérativement plus profondes. Couvrez la fenêtre ouverte avec de la cire d’os et utilisez une fraise de 0,9 millimètre de diamètre pour percer les trous de l’électrode EEG péridurale, en prenant soin de ne pas couper à travers la duramater. Couvrez les trois trous avec de la cire d’os et construisez un mur de ciment dentaire qui englobe la fenêtre d’imagerie et les trous EEG pour lier le mur au capuchon de tête.
Lorsque le ciment a séché, utilisez de la soie tressée noire 4.0 ou 5.0 et de simples sutures interrompues pour fermer les bords lâches de la plaie, et utilisez un applicateur à pointe de coton pour appliquer de la lidocaïne et des pommades antibactériennes sur la peau exposée. Placez ensuite la souris dans une cage chaude avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Un jour après l’inspection de l’implantation de la capuche, fixez la capuchon de tête à une barre de montage personnalisée fixée au cadre stéréotaxique pour positionner la souris éveillée en toute sécurité sur le cadre tout au long de la séance d’imagerie.
Insérez les électrodes d’enregistrement EEG péridurales au sol dans le trou central postérieur et insérez les électrodes d’enregistrement dans les trous antérieurs gauche et droit. Les extrémités des fils sont en forme de L et positionnées entre le crâne et le duramater. Pour visualiser le flux sanguin dans l’hippocampe, fixez la queue avec deux doigts pour localiser la veine centrale et, en tenant une seringue à insuline ultra fine équipée d’une aiguille intégrée de calibre 30 parallèle à la queue, insérez l’aiguille côté biseauté vers le haut dans la veine à environ mi-chemin ou aux deux tiers de la base de la queue pour délivrer 200 microlitres de dextron fixable à la lysine à la fluorescéine verte à 5 %.
Utilisez ensuite la pointe pliée d’une aiguille de seringue pour retirer la dure-mère et lancer l’enregistrement par balayage laser confocal. Directement après l’injection de la veine de queue, fixez le faisceau de fibres optiques biseautées de 300 microns au bras mobile du variateur stéréotaxique robotisé dans une orientation vers le bas. Le système de retenue permet d’enregistrer de manière stable le flux sanguin des microvaisseaux cérébraux profonds, y compris les capillaires et leurs cellules murales proximales, pendant de longues heures.
Dans cette analyse représentative de microvaisseaux entiers, des arrêts du flux sanguin se sont produits au niveau des cellules murales marquées. La quantité d’enregistrements de fibres peut être déterminée en comparant des enregistrements d’imagerie à deux photons à haute résolution du flux sanguin à des vasospasmes équivalents dans le tissu cortical. L’analyse immunohistochimique sur les sites d’enregistrement montre que les cellules murales de l’hippocampe sont correctement ciblées à l’aide de cette méthode, non seulement en se rétrécissant en réponse au traitement, mais aussi en s’associant spatialement à des sténoses dans les microvaisseaux éloignés des artères.
La maîtrise de la chirurgie stéréotaxique et de l’injection latérale de la veine caudale est cruciale pour effectuer ce protocole. Une pratique approfondie est essentielle pour réduire les erreurs et améliorer la précision. La technique permet d’imager en temps réel la dynamique du flux sanguin dans les structures cérébrales profondes, ce qui la rend adaptée à l’étude des pathologies du système vasculaire et à l’évaluation de l’efficacité des traitements qui les ciblent.
