سمح لنا هذا البروتوكول باستخدام المجهر الداخلي للألياف البصرية للمسح بالليزر متحد البؤر لإجراء التصوير المتزامن والتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية في الجسم الحي على مدى عدة ساعات من الهياكل العصبية في أي عمق من الدماغ في المستيقظ أو المخدر نسبيا. لقد طورنا طريقة تقييد غير مؤلمة تسمح بالتصوير العميق للدماغ في المستيقظة باستخدام طريقة مثل تلك المستخدمة سابقا في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية. تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تشوهات الأوعية الدموية الوظيفية في نماذج القوارض من الصرع والضمور البقعي المرتبط بالعمر.
إنها تقنية قابلة للتطبيق لتقييم مساهمة أمراض تدفق الدم في العديد من ، إن لم يكن معظم أعضاء الأمراض. بينما تم تطوير هذه التقنية لدراسة في الوقت الحقيقي لديناميكيات تدفق الدم في الدماغ ، فقد استخدمناها لدراسة تدفق الدم في شبكية العين في الجسم الحي. لا يقتصر على دراسات الأوعية الدموية في الأنسجة العصبية.
سيوضح الإجراء خوسيه ماريا غونزاليس مارتن ، وهو فني مؤهل تأهيلا عاليا من مختبري. بعد التأكد من عدم الاستجابة لمنعكس البتلة ، ضع الأسنان داخل فتحة شريط اللدغة ، وقم بتثبيت رأس الماوس في إطار مجسم للقوارض. شد مشبك الأنف حتى يصبح دافئا.
يجب أن يكون وضع الجسم مستقيما قدر الإمكان. استخدم قضبان الأذن مع أصفاد حامل الفك لتأمين الرأس بحيث تكون العمليات الوجنية للجمجمة داخل المشبك. بعد تنظيف فروة الرأس وتعقيمها ، قم بعمل شق من 12 إلى 15 ملم على طول خط الوسط من قاعدة الجمجمة إلى بين العينين على طول خط الوسط السهمي للجمجمة ، واستخدم أربعة مشابك بلدغ مصقولة مقاس 28 ملم لسحب حدود فروة الرأس ، وكشف الجمجمة ، وزيادة مساحة العمل.
اكشط السمحاق حتى حواف الشق ، وجفف الجزء العلوي من الجمجمة. قم بقياس ارتفاع الجمجمة على أي مسافة خلفية لبريجما ، ومسافتين متساويتين جانبيتين من خط الوسط على جانبي الجمجمة. حدد النقطة المستهدفة ، الحصين الأيمن بمساعدة أطلس مجسم.
على الجمجمة ، ابحث عن إحداثيات نقطة الهدف بالنسبة إلى bregma باستخدام التركيب المجسم ، واستخدم علامة جراحية لتحديد أربع زوايا لنافذة تصوير 1.4 × 2 ملليمتر تتمحور حول النقطة المستهدفة مباشرة فوق الحصين. استخدم العلامة الجراحية لرسم علامة إضافية على العظم الجداري الأيسر العلوي ، وأخرى فوق العظم الجبهي الأيمن لمسامير العظام. استخدم العلامة لرسم ملليمتر واحد على كل جانب من خط الوسط ، ونقطة واحدة على خط الوسط ملليمتر واحد خلف لامدا للإشارة إلى نقاط إدخال قطب تسجيل EEG فوق الجافية.
لتثبيت غطاء الرأس ، قم بتجهيز مثقاب أسنان بلدغ قطره 0.7 ملم ، وقم بحفر فتحتين صغيرتين بعناية في الجمجمة عند نقاط وضع المسمار العظمي. في المكان التالي ، تم تعقيم برغي عظمي من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 70 إلى 80٪ من الإيثانول بأربعة ملليمترات بقطر 0.85 في كل حفرة ، مع الحرص على ألا تبرز أطراف المسمار خارج الجزء السفلي من العظم في تجويف الجمجمة. ثم استخدم قطعة محاذاة مخصصة على شكل حرف L مثبتة على محرك الأقراص الصغير المثبت على الجهاز التجسيمي لمحاذاة غطاء الرأس على طول خط الوسط مع الحافة الأمامية التي تغطي bregma ، وأدخل اثنين من مسامير محرك Fillister المشقوقة فوق bregma حتى تستقر البراغي بشكل مسطح على الجمجمة ، مع الحرص على عدم ممارسة الكثير من الضغط على الجمجمة.
لإعداد نافذة التصوير ، قم بحفر ثقب نتوء قطره 0.7 ملم في كل موضع من مواضع العلامات المرجعية لحج القحف لزوايا نافذة التصوير قبل استخدام المثقاب لتحديد محيط نافذة حج القحف 1.4 × 2 ملليمتر برفق مع قطع أعمق بشكل متكرر. قم بتغطية النافذة المفتوحة بشمع العظام ، واستخدم لدغا قطره 0.9 ملم لحفر ثقوب قطب EEG فوق الجافية ، مع الحرص على عدم قطع القادر. قم بتغطية الثقوب الثلاثة بشمع العظام ، وقم ببناء جدار من الأسمنت السني الذي يشمل نافذة التصوير وثقوب EEG لربط الجدار بغطاء الرأس.
عندما يجف الأسمنت ، استخدم 4.0 أو 5.0 حرير مضفر أسود وخيوط بسيطة متقطعة لإغلاق أي هوامش جرح فضفاضة ، واستخدم قضيبا برأس قطني لتطبيق الليدوكائين والمراهم المضادة للبكتيريا على الجلد المكشوف. ثم ضع الماوس في قفص دافئ مع المراقبة حتى الشفاء التام. بعد يوم واحد من مسح زرع غطاء الرأس ، قم بتأمين غطاء الرأس بقضيب تثبيت مخصص متصل بالإطار التجسيمي لوضع الماوس المستيقظ بإحكام على الإطار طوال جلسة التصوير.
أدخل أقطاب تسجيل EEG فوق الجافية الأرضية في الفتحة المركزية الخلفية ، وأدخل أقطاب التسجيل في الثقوب الأمامية اليسرى واليمنى. أطراف الأسلاك على شكل حرف L ، وتوضع بين الجمجمة والدورامتر. لتصور تدفق الدم داخل الحصين ، قم بتأمين الذيل بإصبعين لتحديد موقع الوريد المركزي ، وحمل حقنة أنسولين فائقة الدقة مزودة بإبرة قياس 30 مدمجة موازية للذيل ، أدخل جانب الإبرة المائل لأعلى في الوريد في منتصف الطريق تقريبا إلى ثلثي قاعدة الذيل لتوصيل 200 ميكرولتر من 5٪ فلوريسئين أخضر ديكستران قابل للتثبيت.
ثم استخدم الطرف المثني لإبرة حقنة لإزالة الجافية وبدء تسجيل المسح بالليزر متحد البؤر. مباشرة بعد حقن الوريد الخلفي ، قم بتثبيت حزمة الألياف الضوئية المشطوفة 300 ميكرون بالذراع المتحرك للمحرك التجسيمي الروبوتي في اتجاه هبوطي. يسمح نظام التقييد بتسجيلات تدفق الدم المستقرة للأوعية الدقيقة العميقة في الدماغ ، بما في ذلك الشعيرات الدموية وخلاياها الجدارية القريبة على مدار ساعات طويلة.
في هذا التحليل التمثيلي للأوعية الدقيقة بأكملها ، حدث توقف تدفق الدم في الخلايا الجدارية الموصوفة. يمكن تحديد كمية تسجيلات الألياف من خلال مقارنة تسجيلين فوتونيين للتصوير عالي الدقة لتدفق الدم إلى التشنجات الوعائية المكافئة داخل الأنسجة القشرية. يوضح التحليل الكيميائي المناعي في مواقع التسجيل أن الخلايا الجدارية الحصين مستهدفة بشكل صحيح باستخدام هذه الطريقة ، ليس فقط الانقباض استجابة للعلاج ، ولكن أيضا الارتباط المكاني بالتضيقات في الأوعية الدقيقة بعيدا عن الشرايين.
الكفاءة في الجراحة التجسيمية وحقن الوريد الجانبي أمر بالغ الأهمية لتنفيذ هذا البروتوكول. الممارسة الشاملة ضرورية لتقليل الخطأ وتحسين الدقة. تسمح هذه التقنية بالتصوير في الوقت الفعلي لديناميكيات تدفق الدم في هياكل الدماغ العميقة ، مما يجعلها مناسبة لدراسة أمراض الجهاز الوعائي وتقييم فعالية العلاجات التي تستهدفها.
