このプロトコルにより、共焦点レーザー走査型光ファイバー内視鏡を使用して、覚醒している動物または比較的麻酔をかけられた動物の脳の任意の深部にある神経構造から、数時間にわたってin vivoでイメージングと電気生理学的記録を同時に行うことができました。私たちは、これまで電気生理学的記録に用いられていたような方法を用いて、覚醒した動物の脳深部イメージングを可能にする痛みのない拘束法を開発しました。この方法は、てんかんおよび加齢黄斑変性症のげっ歯類モデルにおける機能的血管異常の研究に使用されています。
これは、疾患のほとんどの臓器ではないにしても、多くの臓器における血流病理学の寄与を評価するための実行可能な手法です。この手法は、脳内の血流動態をリアルタイムに調べるために開発されたものですが、生体内の網膜の血流を調べるためにも利用しています。神経組織の血管研究に限ったことではありません。
手順を実演するのは、私のラボの高度な資格を持つ技術者であるホセ・マリア・ゴンザレス・マーティンです。花弁反射に反応しないことを確認したら、バイトバーの穴の内側に歯を配置し、ネズミの頭をげっ歯類の脳定位固定フレームに安定させます。ノーズクランプをぴったりと締まるまで締めます。
体の位置はできるだけまっすぐにする必要があります。顎ホルダーの袖口付きのイヤーバーを使用して、頭蓋骨の頬骨突起がクランプ内に収まるように頭を固定します。頭皮を洗浄して滅菌した後、頭蓋骨の付け根から目の間まで、頭蓋骨の矢状正中線に沿って正中線に沿って12〜15ミリメートルの切開を行い、4つの28ミリメートルのブルドッグセレファインクランプを使用して頭皮の境界を引っ込め、頭蓋骨を露出させ、作業領域を最大化します。
骨膜を切開部の端までこすり、頭蓋骨の上部を乾かします。ブレグマの後方の任意の距離で頭蓋骨の高さを測定し、頭蓋骨の両側の正中線から外側に2つの等しい距離を測定します。脳定位固定装置アトラスの助けを借りて、ターゲットポイントである右海馬を特定します。
頭蓋骨で、ブレグマを基準にした目標点の座標を定位で見つけ、外科用マーカーを使用して、海馬の真上の目標点を中心とする1.4 x 2ミリメートルの画像窓の四隅に印を付けます。サージカルマーカーを使用して、左上の頭頂骨の上に追加のマークを描き、右前頭骨の上に骨スクリュー用の別のマークを描きます。マーカーを使用して、正中線の両側に1ミリメートルを1つずつ描き、ラムダの1ミリ後ろの正中線上に1つの点を描画して、硬膜外脳波記録電極挿入点を示します。
ヘッドキャップを取り付けるには、歯科用ドリルに直径0.7ミリのバリを装備し、頭蓋骨の骨ねじ配置ポイントに2つの小さな穴を慎重に開けます。次に、70〜80%エタノール滅菌した直径0.85ミリメートルのステンレス鋼のスロット付き骨ネジを各穴に1つ置き、ネジの先端が骨の底を超えて頭蓋腔に突き出ないように注意します。次に、脳定位固定装置に取り付けられたマイクロドライブにクランプされたL字型のカスタムアライメントピースを使用して、ヘッドキャップを正中線に沿ってブレグマの上にある前隆起に合わせ、頭蓋骨に過度の圧力をかけないように注意しながら、ネジが頭蓋骨に平らになるまでブレグマの上に2本のフィリスターヘッドスロット付きドライブネジを挿入します。
イメージングウィンドウを設定するには、イメージングウィンドウの角にある開頭術基準マークの各位置に直径0.7mmのバリ穴を開けてから、ドリルを使用して1.4×2mmの開頭窓の周囲を反復的に深い切り込みで穏やかに描きます。開いた窓を骨ワックスで覆い、直径0.9mmのバリで硬膜外脳波の電極穴を開け、硬膜外脳波の電極穴を開けます。3つの穴を骨ワックスで覆い、イメージングウィンドウとEEG穴を囲む歯科用セメントの壁を構築して、壁をヘッドキャップに結合します。
セメントが乾いたら、4.0または5.0の黒い編組シルクと単純な中断縫合糸を使用して緩い創傷マージンを閉じ、綿の先端アプリケーターを使用して、露出した皮膚にリドカインと抗菌軟膏を塗布します。次に、マウスを温かいケージに入れ、完全に回復するまで監視します。ヘッドキャップ移植調査の1日後、脳定位固定装置フレームに取り付けられたカスタム取り付けバーにヘッドキャップを固定して、イメージングセッション全体を通して覚醒マウスをフレームにしっかりと配置します。
地盤硬膜外脳波記録電極を後中央穴に挿入し、記録電極を前方左右の穴に挿入します。ワイヤーの先端はL字型で、頭蓋骨とデュラマターの間にあります。海馬内の血流を視覚化するには、尾部を2本の指で固定して中心静脈の位置を特定し、尾部と平行に30ゲージの針が内蔵された超極細インスリン注射器を持ち、針の斜角側を上にして、尾部の付け根から約半分から3分の2の静脈に挿入して、200マイクロリットルの5%緑色フルオレセインリジン固定デキストランを送達します。
次に、シリンジ針の曲がった先端を使用して硬膜を取り除き、共焦点レーザースキャン記録を開始します。尾静脈注射の直後に、300ミクロンの斜めの光ファイバーバンドルを下向きにロボット脳定位固定装置ドライブの可動アームにクランプします。拘束システムにより、毛細血管やその近位壁細胞を含む脳深部微小血管の血流記録を長時間にわたって安定して記録することができます。
この微小血管全体の代表的な解析では、標識された壁画細胞で血流停止が起こりました。線維記録の量は、血流の高解像度の2光子イメージング記録を皮質組織内の同等の血管痙攣と比較することによって決定できます。記録部位での免疫組織化学的解析は、海馬壁画細胞がこの方法を用いて正しく標的化され、治療に反応して収縮するだけでなく、動脈から遠く離れた微小血管の狭窄と空間的に会合することを示しています。
このプロトコルを実行するには、定位固定手術と側尾静脈注射の習熟度が重要です。エラーを減らし、精度を向上させるには、徹底した練習が不可欠です。この技術により、脳深部構造の血流動態をリアルタイムでイメージングできるため、血管系の病態を研究し、それらを標的とする治療の有効性を評価するのに適しています。
