Este protocolo nos permitiu usar o endomicroscópio confocal de varredura a laser de fibra óptica para realizar imagens simultâneas e registros eletrofisiológicos in vivo durante várias horas a partir de estruturas neurais em qualquer profundidade do cérebro no animal acordado ou relativamente anestesiado. Desenvolvemos um método de contenção indolor que permite imagens cerebrais profundas em animais acordados usando métodos como os anteriormente empregados para registros eletrofisiológicos. Este método tem sido utilizado para estudar anormalidades vasculares funcionais em modelos de roedores de epilepsia e degeneração macular relacionada à idade.
É uma técnica viável para avaliar a contribuição da patologia do fluxo sanguíneo em muitos, senão na maioria dos órgãos das doenças. Embora esta técnica tenha sido desenvolvida para um estudo em tempo real da dinâmica do fluxo sanguíneo no cérebro, nós a usamos para estudar o fluxo sanguíneo na retina in vivo. Não se limita a estudos vasculares em tecido neural.
Quem demonstrará o procedimento será José Maria Gonzalez Martin, um técnico altamente qualificado do meu laboratório. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo da pétala, coloque os dentes dentro do orifício da barra de mordida e estabilize a cabeça do camundongo em uma estrutura estereotáxica de roedores. Aperte a pinça do nariz até que fique confortável.
A posição do corpo deve ser a mais reta possível. Use barras auriculares com manguitos de suporte da mandíbula para prender a cabeça de tal forma que os processos zigomáticos do crânio estejam dentro da braçadeira. Após a limpeza e esterilização do couro cabeludo, faça uma incisão de 12 a 15 milímetros ao longo da linha média, desde a base do crânio até entre os olhos ao longo da linha média sagital do crânio, e use quatro pinças de 28 milímetros para retrair as bordas do couro cabeludo, expondo o crânio e maximizando a área de trabalho.
Raspe o periósteo até as bordas da incisão e seque o topo do crânio. Meça a altura do crânio a qualquer distância posterior ao bregma, e duas distâncias iguais laterais da linha média em cada lado do crânio. Identificar o ponto alvo, o hipocampo direito com o auxílio de um atlas estereotáxico.
No crânio, encontre as coordenadas do ponto alvo em relação ao bregma com o estereotáxi e use um marcador cirúrgico para marcar quatro cantos de uma janela de imagem de 1,4 por dois milímetros centrada em torno do ponto alvo diretamente acima do hipocampo. Use o marcador cirúrgico para desenhar uma marca adicional sobre o osso parietal superior esquerdo e outra sobre o osso frontal direito para os parafusos ósseos. Use o marcador para desenhar um milímetro de cada lado da linha média e um ponto na linha média um milímetro atrás do lambda para indicar os pontos de inserção do eletrodo de registro do EEG peridural.
Para instalar a tampa da cabeça, equipe uma broca odontológica com uma broca de 0,7 milímetro de diâmetro e faça cuidadosamente dois pequenos furos no crânio nos pontos de colocação do parafuso ósseo. Em seguida, coloque um parafuso ósseo de aço inoxidável esterilizado de 70 a 80% a 80% de etanol de quatro milímetros de 0,85 diâmetro em cada orifício, tomando cuidado para que as pontas do parafuso não se projetem além do fundo do osso para a cavidade craniana. Em seguida, use uma peça de alinhamento personalizada em forma de L presa ao microdrive montado no dispositivo estereotáxico para alinhar a tampa da cabeça ao longo da linha média com a crista anterior sobrejacente ao bregma e insira dois parafusos de acionamento com fenda na cabeça de Fillister sobre o bregma até que os parafusos fiquem planos no crânio, tomando cuidado para não exercer muita pressão sobre o crânio.
Para configurar a janela de imagem, perfure um orifício de broca de 0,7 milímetro de diâmetro em cada uma das posições das marcas de referência de craniotomia para os cantos da janela de imagem antes de usar a broca para delinear suavemente a periferia da janela de craniotomia de 1,4 por dois milímetros com cortes iterativamente mais profundos. Cubra a janela aberta com cera de osso e use uma broca de 0,9 milímetro de diâmetro para perfurar os orifícios do eletrodo de EEG peridural, tomando cuidado para não cortar a dura-máter. Cubra os três orifícios com cera de osso e construa uma parede de cimento dental que englobe a janela de imagem e os orifícios de EEG para prender a parede à calota da cabeça.
Quando o cimento estiver seco, use seda trançada preta 4.0 ou 5.0 e suturas simples interrompidas para fechar as margens soltas da ferida e aplique um aplicador com ponta de algodão para aplicar lidocaína e pomadas antibacterianas na pele exposta. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola quente com monitoramento até a recuperação completa. Um dia após a pesquisa de implantação da tampa da cabeça, prenda a tampa de cabeça a uma barra de montagem personalizada conectada à estrutura estereotáxica para posicionar o mouse acordado firmemente ao quadro durante toda a sessão de imagem.
Insira os eletrodos de registro do EEG peridural no orifício central posterior e insira os eletrodos de registro nos orifícios anterior esquerdo e direito. As pontas dos fios são em forma de L e posicionadas entre o crânio e a dura-máter. Para visualizar o fluxo sanguíneo dentro do hipocampo, prenda a cauda com dois dedos para localizar a veia central e, segurando uma seringa de insulina ultrafina equipada com uma agulha de calibre 30 integrada paralela à cauda, insira o bisel da agulha na veia aproximadamente a meio caminho a dois terços da base da cauda para fornecer 200 microlitros de dextrano lisina fluoresceína 5% verde.
Em seguida, use a ponta dobrada de uma agulha de seringa para remover a dura-máter e iniciar a gravação de varredura a laser confocal. Diretamente após a injeção da veia da cauda, prenda o feixe de fibra óptica chanfrado de 300 mícrons ao braço móvel da unidade estereotáxica robótica em uma orientação descendente. O sistema de contenção permite registros estáveis do fluxo sanguíneo de microvasos cerebrais profundos, incluindo capilares e suas células murais proximais, durante longas horas.
Nessa análise representativa de microvasos inteiros, ocorreram paradas do fluxo sanguíneo nas células murais marcadas. A quantidade de registros de fibras pode ser determinada comparando-se registros de imagem de dois fótons de alta resolução do fluxo sanguíneo com vasoespasmos equivalentes dentro do tecido cortical. A análise imuno-histoquímica nos locais de registro ilustra que as células murais do hipocampo são corretamente direcionadas por esse método, não apenas se contraindo em resposta ao tratamento, mas também se associando espacialmente com estenoses em microvasos distantes das artérias.
A proficiência na cirurgia estereotáxica e injeção lateral da veia caudal é crucial para a realização deste protocolo. A prática completa é essencial para reduzir o erro e melhorar a precisão. A técnica permite imagens em tempo real da dinâmica do fluxo sanguíneo em estruturas cerebrais profundas, tornando-a adequada para estudar patologias do sistema vascular e avaliar a eficácia de tratamentos que as direcionam.
