Questo protocollo ci ha permesso di utilizzare l'endomicroscopio a fibre ottiche confocali a scansione laser per eseguire simultanee immagini e registrazioni elettrofisiologiche in vivo per diverse ore da strutture neurali a qualsiasi profondità del cervello nell'animale sveglio o relativamente anestetizzato. Abbiamo sviluppato un metodo di contenzione indolore che consente l'imaging cerebrale profondo negli animali svegli utilizzando metodi simili a quelli precedentemente impiegati per le registrazioni elettrofisiologiche. Questo metodo è stato utilizzato per studiare le anomalie vascolari funzionali in modelli di roditori di epilessia e degenerazione maculare legata all'età.
È una tecnica praticabile per valutare il contributo della patologia del flusso sanguigno in molti, se non nella maggior parte degli organi delle malattie. Mentre questa tecnica è stata sviluppata per uno studio in tempo reale delle dinamiche del flusso sanguigno nel cervello, l'abbiamo utilizzata per studiare il flusso sanguigno nella retina in vivo. Non si limita agli studi vascolari nel tessuto neurale.
A dimostrare la procedura sarà Jose Maria Gonzalez Martin, un tecnico altamente qualificato del mio laboratorio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso dei petali, posizionare i denti all'interno del foro della barra del morso e stabilizzare la testa del topo in una cornice stereotassica per roditori. Serrare il morsetto nasale finché non è aderente.
La posizione del corpo dovrebbe essere il più dritta possibile. Utilizzare barre auricolari con polsini portamascelle per fissare la testa in modo che i processi zigomatici del cranio si trovino all'interno del morsetto. Dopo aver pulito e sterilizzato il cuoio capelluto, praticare un'incisione da 12 a 15 millimetri lungo la linea mediana dalla base del cranio a tra gli occhi lungo la linea mediana sagittale del cranio e utilizzare quattro morsetti Bulldog da 28 millimetri per ritrarre i bordi del cuoio capelluto, esponendo il cranio e massimizzando l'area di lavoro.
Raschiare il periostio fino ai bordi dell'incisione e asciugare la parte superiore del cranio. Misurare l'altezza del cranio a qualsiasi distanza posteriore al bregma e a due distanze uguali lateralmente dalla linea mediana su entrambi i lati del cranio. Identificare il punto target, l'ippocampo destro con l'aiuto di un atlante stereotassico.
Sul cranio, trova le coordinate del punto target rispetto al bregma con la stereotassa e usa un marcatore chirurgico per segnare quattro angoli di una finestra di imaging di 1,4 x due millimetri centrata attorno al punto target direttamente sopra l'ippocampo. Usa il pennarello chirurgico per disegnare un segno aggiuntivo sull'osso parietale in alto a sinistra e un altro sull'osso frontale destro per le viti ossee. Usa il pennarello per disegnare un millimetro su ciascun lato della linea mediana e un punto sulla linea mediana un millimetro dietro lambda per indicare i punti di inserzione dell'elettrodo di registrazione EEG epidurale.
Per installare il cappuccio della testa, equipaggiare un trapano dentale con una fresa di 0.7 millimetri di diametro e praticare con cura due piccoli fori nel cranio nei punti di posizionamento della vite ossea. Successivamente, posizionare una vite ossea a taglio in acciaio inossidabile da 40 a 80% sterilizzata con etanolo da quattro millimetri di diametro 0,85 in ciascun foro, facendo attenzione che le punte delle viti non sporgano oltre il fondo dell'osso nella cavità cranica. Quindi utilizzare un pezzo di allineamento personalizzato a forma di L fissato al microdrive montato sul dispositivo stereotassico per allineare il cappuccio della testa lungo la linea mediana con la cresta anteriore sovrastante il bregma e inserire due viti di azionamento con intaglio a testa Fillister sopra il bregma fino a quando le viti non si trovano piatte sul cranio, facendo attenzione a non esercitare troppa pressione sul cranio.
Per impostare la finestra di imaging, praticare un foro di 0,7 millimetri di diametro in ciascuna delle posizioni dei segni di riferimento della craniotomia per gli angoli della finestra di imaging prima di utilizzare la fresa per delineare delicatamente la periferia della finestra craniotomica di 1,4 x due millimetri con tagli iterativi più profondi. Coprire la finestra aperta con cera ossea e utilizzare una fresa di 0,9 millimetri di diametro per praticare i fori dell'elettrodo EEG epidurale, facendo attenzione a non tagliare il duramater. Copri i tre fori con cera ossea e costruisci una parete di cemento dentale che comprenda la finestra di imaging e i fori EEG per legare la parete al cappuccio della testa.
Quando il cemento si è asciugato, utilizzare seta intrecciata nera 4.0 o 5.0 e semplici suture interrotte per chiudere eventuali margini della ferita allentati e utilizzare un applicatore con punta di cotone per applicare lidocaina e unguenti antibatterici sulla pelle esposta. Quindi posizionare il mouse in una gabbia calda con monitoraggio fino al completo recupero. Un giorno dopo l'indagine sull'impianto del cappuccio per la testa, fissare il cappuccio per la testa a una barra di montaggio personalizzata attaccata al telaio stereotassico per posizionare il topo sveglio in modo sicuro al telaio durante la sessione di imaging.
Inserire gli elettrodi di registrazione EEG epidurale rettificati nel foro centrale posteriore e inserire gli elettrodi di registrazione nei fori anteriori sinistro e destro. Le punte dei fili sono a forma di L e posizionate tra il cranio e il duramadre. Per visualizzare il flusso sanguigno all'interno dell'ippocampo, fissare la coda con due dita per individuare la vena centrale e, tenendo una siringa da insulina ultra fine dotata di un ago integrato calibro 30 parallelo alla coda, inserire l'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto nella vena a circa metà a due terzi dalla base della coda per erogare 200 microlitri di destrano fissabile alla lisina con fluoresceina verde al 5%.
Quindi utilizzare la punta piegata dell'ago di una siringa per rimuovere la dura e avviare la registrazione della scansione laser confocale. Subito dopo l'iniezione della vena caudale, fissare il fascio di fibre ottiche smussate da 300 micron al braccio mobile dell'azionamento stereotassico robotico con orientamento verso il basso. Il sistema di ritenuta consente registrazioni stabili del flusso sanguigno dei microvasi cerebrali profondi, compresi i capillari e le loro cellule murali prossimali per lunghe ore.
In questa analisi rappresentativa di interi microvasi, si sono verificate interruzioni del flusso sanguigno nelle cellule murali marcate. La quantità di registrazioni in fibra può essere determinata confrontando le registrazioni di imaging a due fotoni ad alta risoluzione del flusso sanguigno con vasospasmo equivalenti all'interno del tessuto corticale. L'analisi immunoistochimica nei siti di registrazione illustra che le cellule murali dell'ippocampo sono correttamente mirate utilizzando questo metodo, non solo restringendosi in risposta al trattamento, ma anche associandosi spazialmente a stenosi nei microvasi lontani dalle arterie.
La competenza nella chirurgia stereotassica e nell'iniezione della vena caudale laterale è fondamentale per eseguire questo protocollo. Una pratica approfondita è essenziale per ridurre gli errori e migliorare l'accuratezza. La tecnica consente l'imaging in tempo reale delle dinamiche del flusso sanguigno nelle strutture cerebrali profonde, rendendola adatta per lo studio delle patologie del sistema vascolare e la valutazione dell'efficacia dei trattamenti che le colpiscono.
