이 프로토콜을 통해 컨포칼 레이저 스캐닝 광섬유 내시경을 사용하여 깨어 있거나 상대적으로 마취된 동물의 뇌 깊이에 있는 신경 구조에서 몇 시간 동안 생체 내에서 동시 이미징 및 전기 생리학적 기록을 수행할 수 있었습니다. 우리는 이전에 전기 생리학적 기록에 사용되었던 것과 같은 방법을 사용하여 깨어 있는 동물의 뇌 심부 영상을 가능하게 하는 통증 없는 구속 방법을 개발했습니다. 이 방법은 간질 및 연령 관련 황반 변성의 설치류 모델에서 기능적 혈관 이상을 연구하는 데 사용되었습니다.
질병의 대부분의 장기는 아니더라도 많은 곳에서 혈류 병리학의 기여도를 평가하는 실행 가능한 기술입니다. 이 기술은 뇌의 혈류 역학을 실시간으로 연구하기 위해 개발되었지만 생체 내 망막의 혈류를 연구하는 데 사용했습니다. 신경 조직의 혈관 연구에만 국한되지 않습니다.
이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 우수한 기술자인 Jose Maria Gonzalez Martin입니다. 꽃잎 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후 치아를 물린 막대의 구멍 안에 넣고 쥐의 머리를 설치류 입체 프레임에 고정시킵니다. 코 cl을 조입니다.amp 꼭 맞을 때까지.
몸의 위치는 가능한 한 직선이어야 합니다. 턱 홀더 커프가 있는 이어 바를 사용하여 두개골의 접합 과정이 cl 내에 있도록 머리를 고정합니다.amp. 두피를 세척 및 소독한 후 두개골 기저부에서 두개골 정중선을 따라 눈 사이까지 정중선을 따라 12-15mm를 절개하고 28mm 불독 세레파인 클램프 4개를 사용하여 두피의 경계를 수축시켜 두개골을 노출시키고 작업 영역을 최대화합니다.
골막을 절개 부위 가장자리까지 긁어내고 두개골 윗부분을 말립니다. 브레그마 뒤쪽의 모든 거리에서 두개골의 높이를 측정하고 두개골 양쪽의 정중선에서 측면으로 두 개의 동일한 거리를 측정합니다. 표적 지점인 오른쪽 해마를 입체 지도책의 도움으로 식별합니다.
두개골에서 스테레오택스를 사용하여 브레그마를 기준으로 한 표적점 좌표를 찾고 수술용 마커를 사용하여 해마 바로 위의 표적점을 중심으로 1.4 x 2mm 이미징 창의 네 모서리를 표시합니다. 수술 마커를 사용하여 왼쪽 상단 두정골 위에 추가 표시를 하고 뼈 나사에 대해 오른쪽 전두골 위에 또 다른 표시를 그립니다. 마커를 사용하여 정중선의 양쪽에 1mm씩 그리고 람다 뒤 1mm의 정중선에 점 하나를 그려 경막외 EEG 기록 전극 삽입 지점을 나타냅니다.
헤드 캡을 설치하려면 치과용 드릴에 직경 0.7mm의 버를 장착하고 뼈 나사 배치 지점에서 두개골에 두 개의 작은 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 다음으로 70-80% 에탄올 멸균 4mm 0.85 직경의 스테인리스 스틸 홈이 있는 뼈 나사를 각 구멍에 넣고 나사 끝이 뼈 바닥을 넘어 두개골강으로 튀어나오지 않도록 주의합니다. 그런 다음 입체 장치에 장착된 마이크로 드라이브에 고정된 L자형 맞춤형 정렬 조각을 사용하여 정중선을 따라 헤드 캡을 브레그마 위에 놓인 전방 융기와 정렬하고 나사가 두개골에 평평하게 놓일 때까지 브레그마 위에 두 개의 필리스터 헤드 슬롯 드라이브 나사를 삽입하여 두개골에 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의합니다.
이미징 창을 설정하려면 드릴을 사용하여 반복적으로 더 깊은 절단으로 1.4 x 2mm 개두술 창의 주변을 부드럽게 묘사하기 전에 이미징 창의 모서리에 대한 개두술 참조 표시의 각 위치에 0.7mm 직경의 버 구멍을 뚫습니다. 열린 창을 뼈 왁스로 덮고 0.9mm 직경의 버를 사용하여 경막외 EEG 전극 구멍을 뚫고 경막외박기를 절단하지 않도록 주의합니다. 세 개의 구멍을 뼈 왁스로 덮고 이미징 창과 EEG 구멍을 둘러싸는 치과용 시멘트 벽을 만들어 벽을 헤드 캡에 묶습니다.
시멘트가 마르면 4.0 또는 5.0 검은색 꼰 실크와 간단한 단속 봉합사를 사용하여 느슨한 상처 가장자리를 닫고 면 팁 어플리케이터를 사용하여 노출된 피부에 리도카인과 항균 연고를 바릅니다. 그런 다음 완전히 회복될 때까지 모니터링하면서 마우스를 따뜻한 케이지에 넣습니다. 헤드 캡 이식 조사 후 하루 동안 헤드 캡을 입체 프레임에 부착된 맞춤형 장착 바에 고정하여 이미징 세션 내내 깨어 있는 마우스를 프레임에 단단히 고정합니다.
접지된 경막외 뇌파 기록 전극을 후방 중앙 구멍에 삽입하고 기록 전극을 전방 좌우 구멍에 삽입합니다. 와이어의 끝은 L 자형이며 두개골과 듀라마터 사이에 위치합니다. 해마 내의 혈류를 시각화하기 위해 두 손가락으로 꼬리를 고정하여 중심 정맥을 찾고 꼬리와 평행한 통합 30게이지 바늘이 장착된 초미세 인슐린 주사기를 잡고 바늘 경사면을 꼬리 기저부에서 약 절반에서 2/3 지점의 정맥에 삽입하여 200마이크로리터의 5% 녹색 플루오레세인 라이신 고정 가능한 덱스트란을 전달합니다.
그런 다음 주사기 바늘의 구부러진 끝을 사용하여 경막을 제거하고 컨포칼 레이저 스캐닝 기록을 시작합니다. 꼬리 정맥 주입 직후 300미크론 비스듬한 광섬유 번들을 로봇 입체 드라이브의 모바일 암에 아래쪽 방향으로 고정합니다. 구속 시스템은 모세혈관과 근위 벽화 세포를 포함한 뇌심부 미세혈관의 혈류를 장시간 동안 안정적으로 기록할 수 있습니다.
전체 미세혈관에 대한 이 대표적인 분석에서, 혈류 정지는 표지된 벽화 세포에서 발생했다. 광섬유 기록의 양은 혈류의 고해상도 2개의 광자 이미징 기록을 피질 조직 내의 동등한 혈관 경련과 비교하여 결정할 수 있습니다. 기록 부위의 면역조직화학적 분석은 해마 벽화 세포가 이 방법을 사용하여 치료에 반응하여 수축할 뿐만 아니라 동맥에서 멀리 떨어진 미세혈관의 협착과 공간적으로 연관되어 올바르게 표적화된다는 것을 보여줍니다.
입체 수술 및 측면 꼬리 정맥 주사에 대한 숙련도는 이 프로토콜을 수행하는 데 매우 중요합니다. 오류를 줄이고 정확도를 높이려면 철저한 연습이 필수적입니다. 이 기술은 뇌 심부 구조의 혈류 역학을 실시간으로 이미징할 수 있으므로 혈관계 병리를 연구하고 이를 표적으로 하는 치료의 효능을 평가하는 데 적합합니다.
