清醒小鼠海马毛细血管的体内纤维耦合临床前共聚焦激光扫描内窥镜 （pCLE）

该协议允许我们使用共聚焦激光扫描光纤内窥镜在清醒或相对麻醉的动物的大脑任何深度的神经结构中进行数小时内的体内同步成像和电生理记录。我们开发了一种无痛的约束方法，允许使用以前用于电生理记录的方法对清醒的动物进行深部脑成像。该方法已用于研究癫痫和年龄相关性黄斑变性啮齿动物模型中的功能性血管异常。

这是一种可行的技术，可以评估血流病理学在许多（如果不是大多数）疾病器官中的贡献。虽然这项技术是为实时研究大脑中的血流动力学而开发的，但我们已使用它来研究体内视网膜中的血流。它不仅限于神经组织中的血管研究。

何塞·玛丽亚·冈萨雷斯·马丁（Jose Maria Gonzalez Martin）将演示该程序，他是我实验室的一名高素质技术人员。在确认对花瓣反射缺乏反应后，将牙齿放在咬杆的孔内，并将小鼠的头部稳定在啮齿动物立体定位框架中。拧紧鼻子夹，直到它紧贴。

身体的位置应尽可能笔直。使用带有颌骨支架袖口的耳杆固定头部，使颅骨的颧突在夹子内。对头皮进行清洁和消毒后，沿颅底的中线沿颅底到颅骨矢状中线的眼睛之间做12至15毫米的切口，并使用四个28毫米的斗牛犬serrefine夹将头皮的边缘缩回，露出颅骨，并最大化工作区域。

将骨膜刮到切口边缘，然后擦干颅骨顶部。测量前囟后方任意距离处的颅骨高度，以及颅骨两侧中线外侧两个相等的距离。借助立体定位图谱确定目标点，即右侧海马体。

在颅骨上，用立体音找到相对于前囟的目标点坐标，并使用手术标记标记以海马正上方目标点为中心的 1.4 x 2 毫米成像窗口的四个角。使用手术标记在左上顶骨上再画一个标记，在右额骨上再画一个标记，用于接骨螺钉。使用记号笔在中线两侧各画一个一毫米，在λ后面一毫米的中线上画一个点，表示硬膜外脑电图记录电极插入点。

要安装头盖，请为牙钻配备直径为 0.7 毫米的毛刺，并在骨钉放置点小心地在颅骨上钻两个小孔。接下来将一个 70% 至 80% 乙醇灭菌的 4 毫米直径 0.85 毫米不锈钢开槽骨螺钉放入每个孔中，注意螺钉尖端不要伸出骨头底部进入颅腔。然后使用夹在安装在立体定位装置上的微型驱动器上的 L 形定制对准件，将头帽沿中线与覆盖前脊的前脊对齐，并在前囟上插入两个 Fillister 头槽驱动螺钉，直到螺钉平放在颅骨上，注意不要对颅骨施加太大压力。

要设置成像窗口，请在成像窗口角的开颅参考标记的每个位置钻一个直径为 0.7 毫米的毛刺孔，然后使用钻头轻轻描绘 1.4 x 2 毫米开颅手术窗口的周边，并迭代更深的切口。用骨蜡盖住打开的窗户，并使用直径为 0.9 毫米的毛刺钻出硬膜外脑电图电极孔，注意不要切穿硬膜。用骨蜡覆盖三个孔，并用牙科水泥墙建造一堵墙，包括成像窗口和脑电图孔，将墙与头盖结合。

水泥干燥后，使用 4.0 或 5.0 黑色编织丝和简单的间断缝合线闭合任何松散的伤口边缘，并使用棉尖涂抹器将利多卡因和抗菌软膏涂抹在暴露的皮肤上。然后将鼠标放在温暖的笼子中，进行监控，直到完全恢复。头帽植入调查后一天，将头帽固定到连接到立体定位框架的定制安装杆上，以在整个成像过程中将唤醒鼠标牢固地定位到框架上。

将地面硬膜外脑电记录电极插入后中央孔，将记录电极插入左右前孔中。钢丝的尖端呈L形，位于头骨和硬骨之间。为了可视化海马体内的血流，用两根手指固定尾巴以定位中央静脉，并握住配备有平行于尾巴的集成 30 号针头的超细胰岛素注射器，将针斜面朝上插入静脉大约一半到尾巴底部的三分之二，以输送 200 微升 5% 绿色荧光素赖氨酸固定葡聚糖。

然后使用注射器针头的弯曲尖端取出硬脑膜并开始共聚焦激光扫描记录。直接在尾静脉注射之后，将 300 微米斜面光纤束向下夹紧到机器人立体定位驱动器的移动臂上。约束系统允许长时间稳定地记录脑深部微血管（包括毛细血管及其近端壁细胞）的血流。

在对整个微血管的代表性分析中，标记的壁细胞处发生了血流停止。通过将血流的高分辨率双光子成像记录与皮质组织内的等效血管痉挛进行比较，可以确定纤维记录的数量。记录部位的免疫组织化学分析表明，使用这种方法可以正确地靶向海马壁细胞，不仅在治疗后收缩，而且在空间上与远离动脉的微血管中的狭窄相关联。

熟练掌握立体定位手术和侧尾静脉注射对于执行该协议至关重要。彻底的练习对于减少错误和提高准确性至关重要。该技术可以对深部脑结构中的血流动力学进行实时成像，使其适用于研究血管系统病理学并评估针对它们的治疗的疗效。