Oenosit diseksiyonu ve lipid damlacık boyama bu yöntem normal ve stresli koşullar altında drosophila larvaosit lipid damlacık görünümünü gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu yöntem sadece böceklerde değil, sadece birkaç küçük değişiklik ile memelilerde de lipid metabolizması incelenmesi için yararlı bir araç sağlar. Yumurtlamak için, 150 bakire dişi sinek ve istenilen genotiplerden 75 erkeği bir yumurtlama şişesine yerleştirin ve şişeyi %60 nem oranına sahip 25 derecelik santigrat derecede ışık geçirmez bir kutunun altına yerleştirin.
Bir saat sonra, yeni bir şişe sinekler aktarın ve sinekler yetişkinler çıkarmadan önce bir saat için yeni şişe de yumurtlamak sağlar. Daha sonra, yumurta12 saatlik açık-koyu döngüsü ile 25 derece Celcius 84 saat boyunca üçüncü instar larvaiçine geliştirmek için izin verin. Açlık tedavisini başlatmadan önce, altı santimetrelik petri kabına uygun büyüklükte bir filtre kağıdı yerleştirin ve bir açlık odası oluşturmak için kağıda bir mililitre PBS ekleyin.
Bir kontrol tedavi odası yapmak için, altı santimetre Petri çanak içine Bloomington standart mısır unu gıda beş mililitre yerleştirin. Odalar hazır olduğunda, yumurta döşeme şişeaynı yaklaşık boyutta instar larvaları toplamak için küçük bir boya fırçası kullanın. Ve her açlığa ve kontrol odasına rastgele 20 larva.
Daha sonra 12, 24 veya 36 saat boyunca kuvözdeki odaları yerleştirin ve/veya açlığı azdir. Tedavi süresinin sonunda, larvaları her odadan buz gibi pBS içeren bir diseksiyon plakasına nazikçe aktarmak ve plakayı stereo mikroskop altına yerleştirmek için çersepskullanın. Orient ilk larva ventral tarafı yukarı ve yavaşça yerde larva tutmak için forceps kullanın.
Larvayı tabağa sabitlemek için bir iğneyi yuvara, diğer iğneyi de spiracle'den geçirin. Vannas bahar makası kullanın ve epidermisin içinden ön simetreden hayvanın arka ucuna kadar uzunlamasına bir kesi yapın. Epidermisin iç dokusunu çıkarmak için forceps kullanın, epidermisin iç yüzeyinde oenositlerin zarar görmesini önlemek için özen.
Daha sonra diseksiyon pimlerini almak ve epidermisin buz üzerindeki 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarılması için forceps kullanın. Lipid damlacık boyama için, bir rotator oda sıcaklığında 30 dakika fiksasyon tampon diseksiyon epidermis inkübül, PBS bir mililitre hızlı bir resuspension takip. Daha sonra herhangi bir artık fiksatif kaldırmak için yıkama başına PBS bir mililitre üç beş dakikalık yıkar ile örnekleri yıkayın.
Son yıkamadan sonra epidermal numuneleri uygun bir lipofilik probu ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında rotator üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, dokuları ışıktan korumak için numune tüplerini folyoya sarın ve numuneleri bir mililitre PBS'de yıkama başına 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Oenositleri görüntülemek için, her epidermis örneğini temiz bir mikroskop slaytına monte eden altı mikrolitreye aktarın, dokunun yönünü ayarlayın, böylece oenositleri içeren iç yüzey slaytın dibine dokunuyor.
Yavaşça epidermisin üzerine bir kapak yerleştirin ve kenarları açık oje ile kapatın. Cila kuruduğunda, bir konfokal mikroskop üzerinde görüntü örnekleri, uygun uyarma ve emisyon dalga boyları ile 63 X büyütme koymak. Farklı gelişim evrelerinde normal beslenme larvalarının oenositlerinde birkaç saptanabilir lipid damlacıkları vardır.
Ancak bu temsili görüntülerde de görüldüğü gibi, 12, 24 ve 36 saatlik açlık perilerine yanıt olarak oenositler içinde lipid damlacıklarının sayısı artmaktadır. Bu yöntem, genetik veya çevresel manipülasyonların hücrelerde lipid damlacık değişikliklerine neden olup olmadığını araştırmak için ilgili araştırma alanlarındaki araştırmacılariçin kolay ve uygulanabilir bir protokol sağlar.
