Bu teknik, sistemik protein ve metabolitlerin glomerüler filtrasyon oranları ve tübüler fizyolojiye katkıları da dahil olmak üzere tek nefron fizyolojisi ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu mikropuncture tekniğinin en büyük avantajı Bowman'ın uzayına ve tüm farelerdeki kortikal nefrona erişime izin veriyor olmasıdır. Genellikle, doğru yürütülmüş hazırlık adımları gerektirdiğinden, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek.
Parmak tutam yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, gözlere merhem uygulamak ve 20 ila 25 gram yetişkin fare ekstremiteleri hareketsizleştirmek için bant kullanın. Hayvanın sol tarafındaki tüm tüyleri çıkarmak için bir depilatif krem kullanın ve dalak sırt ve kaudal tarafında deri yoluyla sol böbrek bulmak için dalak kullanın. Deride 0.5 santimetrelik bir kesi yapın, ardından peritondaki daha küçük bir kesi böbreğin içinden geçilebilecek kadar büyük.
Nazik basınç ile böbrek ekstrüzyon ve doku etrafında bir polisiloksane böbrek stabilizatör formu yerleştirin. Böbreği spacer ile hizalayın, böbreğin daha sonraki yüzeyi dengeleyicinin ötesine yaklaşık bir milimetre kadar uzanır ve böbreği siyanoakrilat yapıştırıcısı ile forma sabitler. Bir baş plakayı dengeleyici formuna yapıştırın ve baş plakayı taban plakasına monte eden çubuklara monte edin.
Daha sonra, polisiloksane desteğinde kuyuyu yüzde bir agarose çözeltisi ile doldurun ve agarose sağlam olana kadar formun üzerinde 10 milimetrelik bir kapak fişi tutun. Kapağı tutkalla baş plakaya kapatın ve diş çimentosu ile kapak fişinin etrafında bir halka oluşturun. Daha sonra 100 ila 150 mikrolitre FITC-Dextran retro-orbitally enjekte edin ve fareyi ve fiksasyon plakasını hızlı bir şekilde iki fotonlu mikroskop aşamasına taşıyın.
Böbrek yüzeyine elle odaklandıktan sonra, taramayapmayan iki foton moduna geçin ve kapak kaymasının 30 mikrometrealtında ve lateral böbrek kapsülünden 400 mikrometreden daha az bir hedef glomerulus bulmak için görüntüleme penceresini keşfedin. Hedef glomerulusa yanal ve dikey mesafeyi kaydedin. Daha sonra glomerulus için x, y ve z sahne koordinatlarını kaydedin.
Ve son olarak, x ve y sahne koordinatlarını değiştirmeden su sütununa yaklaşık bir milimetre nesnel odak noktasını yükseltin. Pipet ucunu su sütununa doğru sür ve DAPI uyarmasını açın. X ve y boyutlarındaki pipetleri ucun maksimal floresan noktasına taşıyın.
Bu hedefin merkezi olacak. X citation ayarını kırmızı floresan proteine çevirin ve oküler görünümde hassas merkezleme sağlamak için pipeti oküler ile görselleştirin. Canlı iki foton görünümü altında pipet bulmak ve görüntünün tam ortasına ucu yerleştirmek için iki foton geri geçin, bu kayıt pozisyonudur.
Daha sonra pipetin görüntüsünü kaydedin ve sahne ve mikropipet denetleyicikoordinatlarını kaydedin. Pipeti y ve z eksenini hareket ettirmeden x eksenindeki su sütunundan çıkarın ve pipet z'yi hedef glomerulus z-koordinatına ve böbreğin kenarına taşıyın. Aşama x'i not edin ve kayıt aşamasından x ofset kullanarak böbrek kenarı pipet x'i hesaplayın.
Sahne x böbrek kenarı ekranın çok solunda olana kadar pipet doğru sahne taşımak için artırın, görünür kalırken. Hızlı bir şekilde yaklaşık 100 mikrometre uzaklıkta böbrek kenarı pipet X sadece hesapladı gelen pipet ilerlemek. Kırmızı kazancı artırın ve kırmızı piksel histogramını izlerken pipet ucunu canlı iki foton görüntüleme altında böbrek kenarına yavaşça ilerletmeye başlayın.
X eksenindeki pipeti yavaşça glomerulus hedef pipet x'e doğru sür, sahne x'te bir göz kulak olarak. Glomerulusulaştıktan sonra, bir z-yığını ile konumunu belge. Pipet pozisyonda, iki dakika içinde perfluorodecalin 100 nanolitre enjekte etmek için mikropompa ayarlayın.
Pipetin açık olmasını sağlamak ve giriş sırasında pipet takılığından kaynaklanan kafa karıştırıcılığı azaltmak. Filtrasyon dört ila altı dakika sonra, dakikada 50 nanolitre kadar bir oranda 300 nanolitre kadar aspire mikropompa ayarlayın. Bu güzel, yüzeye yakın glomerulus, glomerulusun böbrek kapsülünün 20 mikrometre altındaki yüzey konumu nedeniyle olumlu görüntüleme gösterir.
Glomerulus mikroenjeksiyon için yüzeye çok yakındır, çünkü pipet kapak kaymasına çarpar. Bu glomeruli en iyi yan kenarları ile konumlandırılmış 250 sağa mikrometre ve kapsül onların 70 mikrometre derinliği nedeniyle kırılma nedeniyle daha az keskin görünen. Glomeruli erişilebilir hale her iki faktör.
Bu tipik böbrek giriş imgesinde, ortogonal görünümlere sahip bir z yığınından ortalama yoğunluk projeksiyonu Bowman'ın alanı içindeki pipet ucunu ortaya çıkarır, ucun konik bölümünde düzenlenmiş kuantum noktalarının son derece parlak floresanından kırmızı pipet ucu spektral artifasını gösterir. Burada, Bowman'ın boşluğuna bir pipet yerleştirdikten sonra elde edilen bir z yığınından elde edilen bir hacim, kapiller tuft'a bitişik alan içindeki pipet ucunu gösterir. Çok büyük bir açıklık ile bir pipet kullanılırsa, böbrek kapsülü subkapsüler kanama ve pipet lümen içine kan girişine neden kırabilir.
Bu yöntem kullanılarak, 17 protein, öncelikle düşük molekül ağırlığı, protein başına en az iki benzersiz peptidler tespit edilmiştir. Bu yöntemle birlikte, maspectroscopy, iyon duyarlı elektrot ölçümleri ve floresan antikor enjeksiyonu gibi diğer yöntemler tübüler ve glomerüler fizyolojide luminal solutes rolü ile ilgili soruları cevaplamak için kullanılabilir.
