Biz Veronica Schreiter onun mükemmel teknik yardım ve kurulan dondurma tekniği ve hücre kültür modeli yararlı değişiklikler için teşekkür ederim. Ayrıca, biz gibi Maren Anders ve Swanhild Rodewald daha sonraki analiz onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim.

Not: Sığır yumurtalıklar ticari bir mezbaha elde edilmiştir. Mezbaha yan topluluğu Alman yasalarına göre etik bir onay gerektirmez.
1. çalışma koşulları ve hazırlıkları
<ol><li>Kısırlık garantilemek için tüm medya gerçekleştirmek ve doku hazırlık yanı sıra tüm kültür bir laminar akış Bank kullanarak bir özel hücre kültür laboratuarda çalışıyorum.</li>
	<li>1 x 100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve yumurtalık taşıtlar için 0,5 µg/µL amfoterisin ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) hazırlayın. Not: Bu kurulum içinde 2 h yumurtalık alma ve GC yalıtma arasında maksimal süresi kadardır.</li>
</ol>2. izolasyon sığır Granulosa hücre
<ol><li>
Yalıtım yordamına başlamadan önce yüzeyden herhangi bir kan kaldırmak için yumurtalıklarda birkaç kez 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) yıkayın. Bir ölçek kullanın, yumurtalık içinde yer, 1 x PBS ile doldurun ve PBS tekrar atmak.
	<ol>
<li>Yumurtalık kalan herhangi bir kan temizlenir bu kadar yıkama 3 – 4 x, tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir yumurtalık mümkün contaminations en aza indirmek için % 70 alkol ile batırılmış bir laboratuvar silin kullanarak silin.</li>
	<li>3 mL şırınga ve bir 18 G iğne ile küçük ve orta boyutlu köklerinin delinme tarafından GC Aspire edin (< cetvelle ölçülür 6 mm) ve bir 50 mL santrifüj tüpü foliküler sıvı Havuzu. Not: şırınga nemlendirmek için 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) küçük bir miktar alır. Bu Folliküler sıvı az miktarda toplamak için yardımcı olur ve hücre şırınga yapışmasını önler.</li>
	<li>Birkaç köklerinin delinme sonra şırınga ve iğne ara temizlik için 1 x PBS ile yıkayın.</li>
</ol>3. hücre dondurma
<ol><li>
Trypan mavi boyama kullanın ve bir hemasitometre altında hücreleri saymak.
	<ol>
<li>Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak. Not: trypan mavi mavi görünür ölü hücreleri hücre bariyer sadece erişebildiğinden canlı hücreler günahı kalır.</li>
		<li>15 µL granulosa hücre süspansiyon trypan mavi ekleyin ve onları hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Karışımı bir hemasitometre her iki odasında yerleştirin. Yaşam saymak (günahıÖrneğin,) bir büyük kare başına odası hücrelerde. Not: her ne kadar bazı kan hücreleri görülebilir, onlar onların çok küçük boyutuna göre ayrılır.</li>
		<li>Genel esaslarına göre her iki odası kareler ortalaması ile canlı hücreler sayısını hesaplamak; canlı hücreler oranını yumurtalık arasında değişebilir ama %6013aşmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir örnek daha ayrıntılı bir çözümleme için bir başvuru olarak taze izole granulosa hücre havuzundan al.
	<ol>
<li>İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara. Not: sonraki diğer analizleri farklı, genellikle yüksek hücre sayıları gerektirebilir RNA izolasyon sonraki gen ifadesinin değerlendirilmesi için 1 x 105 hücreleri yeterli, olanlardır.</li>
		<li>Bir veya daha fazla aliquots başvuru hücre taze bir tüp içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında ve hücre Pelet elde etmek için en yüksek hızı (12.000 x g) 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hemen şok-örnekleri sıvı azot kıpırdama. Örnek-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dondurma aşağıdaki gibi yapın.
	<ol>
<li>Dondurucu orta % 80 fetal buzağı serum (FCS) ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça GC cips için GC için oda sıcaklığında ve 500 x g3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın ve yavaşça hücreleri resuspend yok daha fazla hücre kadar % 100 FCS (Örneğin, 1 mL) içinde kümeleri görülebilir.</li>
		<li>1 birim (Örneğin, 1 mL) hazır dondurma Orta hücre süspansiyon ekleyin ve karışımı kriyojenik bir şişe aktarın. Not: Soğutucu koruma medya son konsantrasyonu % 90 FCS ve % 10 DMSO olacaktır.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi hızlı donma engelleyen bir uzman (ticari olarak mevcut) dondurma kapsayıcısına getirin. Soğutma hızı örnekleri-1 ° C/dak Transfer dondurma konteyner içine en az 4 h için-80 ° C dondurucu aşmaması gerekir.</li>
		<li>Daha uzun depolama için kriyojenik şişeleri Ultra düşük sıcaklık kaplarda (Örneğin, sıvı faz azot konteynerler) yerleştirin. Not: protokol, burada, dondurma daha uzun depolama sağlar gibi durdurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medya ve kültür plakaları için hazırlanması hücre kültürü
<ol><li>
Hücre kültür plakaları %0.02 kollajen R. ile kat Not: Kollajen R GC geliştirilmiş bir ek olarak kültür için gerekli olduğu bilinmektedir.<ol>
<li>Arıtılmış su hücre kültürü için uygun bir %0.02 kollajen R çözümle hazırlayın.</li>
		<li>İyi ücret 150 µL bir 24-şey tabak içinde eklemek (= 2 cm2/de) ve kültürünün bütün yüzeyi de kolajen R çözüm ile kaplıdır.</li>
		<li>Bir kaç saatliğine açık kapaklı kuru veya laminar akış mahallede bir gecede çözüm ver.</li>
		<li>Kültür plaka tamamen kuru olduğunda, onları kirlenme en aza indirmek 10-15 dk için UV ışığıyla ışınlatayım.</li>
		<li>Gerekirse, plakayı 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya ve kültür iş laminar akış başlık altında için ek hazırlamak. GC başarılı bir kurtarma için onlar hemen çözdürme sonra işlenmek üzere var.</li>
	<li>
Aşağıdaki ortam hazırlamak.
	<ol>
<li>2 mM L-glutamin, %0.084 sodyum bikarbonat, % 0,1 sığır serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Sodyum selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insülin ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ile α-Minimal gerekli ortam (α-MEM) ek.</li>
		<li>Ayrıca, 100 IU penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ortamına Ekle. Not: bir kez ısındı, antibiyotikler, yaklaşık 48 saat için stabildir. Bu nedenle, aliquot kültür set-up için medya ve planlanan medya istenilen miktarda Döviz. Yalnızca medya aliquots 37 ° c su banyosu içinde önceden ısıtmak. Hazırlanan medya artık 3 aydan fazla için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Steroid kültürlü sığır GC etkinliğinde ikna etmek için α-MEM Ayrıca 20 ng/mL folikül - uyarıcı hormon (FSH) ile 50 ng/mL R3 IGF-1 ve 2 µM androstenedion takviyesi. Not: Her zaman kısa bir süre önce bir kültür veya ortam değişimi başlangıcı bu bileşenler ek. Bu steroid etkinlik tehlikeye atabilir FSH ve IGF-1 hisse senedi çözümleri için tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. hücre kültür çalışma
<ol><li>Hücreleri hızlı bir şekilde su banyosu için 3-4 dk 37 ° C'de erimek ve hücre süspansiyon 37 ° C önceden ısıtılmış α-MEM (olmadan hormon takviyesi) içine aktarın. Santrifüjü için son hacmi 10 mL önerilir.</li>
	<li>3 dakika oda sıcaklığında ve 500 x gde GC santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Önceden ısıtılmış ve desteklenmiştir α-MEM ekleyin ve hücreleri dikkatle resuspend.</li>
	<li>Tohum GC, 1 x 105 veya iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğu son hacmi 500 µL. Teknik çoğaltır koşul başına en az üç kültür Wells içerir.</li>
	<li>8 d için bir kuluçka-37 ° c % 5 CO2 hücre kültüründe kuluçkaya.</li>
	<li>Ortam değişimi her geçen gün gerçekleştirmek. Sadece üçte iki kültür ortamının stresi azaltmak için ve taze medya hücrelere uyarlaması kolaylaştırmak için değiştirin. Not: GC kültür birkaç gün sonra tipik bir fibroblast benzeri fenotip oluşturmak ve birlikte küme eğilimindedir. Yüksek hücre yoğunluğu kültüründe daha büyük kümeler normal yoğunluk GC Kültür (Şekil 1, doğru kapı aynası sol vs ) ile karşılaştırıldığında daha sık bulunmuştur.</li>
</ol>6. daha sonraki analiz kültürlü Granulosa hücre
<ol><li>Steroid hormon analizi gerçekleştirmek için ortam toplamak ve -20 ° C'de dondurmak Harcanan medya [Örneğin, radioimmunoassay (RIA)]14östradiol ve progesteron konsantrasyon çözümlemek için uygun yöntemleri kullanın.</li>
	<li>Farklı hedef molekülleri (RNA, DNA, protein vb.)sonraki analiz için uygun bir lysing Ajan ile kültür çanak doğrudan hücrelerde tedarikçi tarafından önerildiği gibi koşullar. Not: lysed hücreleri-20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir çoğu yalıtım yordamları için burada, protokolü durdurmak mümkündür. Daha uzun depolama için hücreleri-80 ° C'de tutulmaları gerekir</li>
	<li>Transkript bereket belirlemek, cDNA sentez ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri15tarafından belirli transkript ölçmek için. İstatistiksel değerlendirme farklı hücre kültürleri, farklı hücre hazırlıkları (biyolojik çoğaltır) kökenli en az üç çoğaltmalar içermelidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)13bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri17dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.
FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.
Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma16için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.
Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.
Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma13ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.
Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.

Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization4boyunca önemli bir rol oynamaktadır.
GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi5göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır6kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar7' den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion10' a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez11anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre12deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 182-05</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotericin (250 &#181;g/ml)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>A 2612</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml syringe (Omnifix Luer)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4616025V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G needle</td>
			<td>Roth</td>
			<td>C724.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>S 0115</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-preservation vials (2 ml)</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 89020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX cell freezing container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture dish, 24-well, flat bottom</td>
			<td>TPP Faust</td>
			<td>TPP 92424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagen R (0.2 %)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>F 0915</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin (200 mM)</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0282</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1713</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>L 1603</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td>dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin (10 mg/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0516</td>
			<td>dissolved in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEA</td>
			<td>Merck-Millipore</td>
			<td>K 0293</td>
			<td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4021</td>
			<td>we prefer to use a stock solution of 2 &#181;g/ml, diluted in 0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR3-IGF-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I1146</td>
			<td>we use a stock solution of 2 &#181;g/ml, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/ml BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>androstenedione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46033</td>
			<td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.

GC fibroblastlar için karşılaştırılabilir bir hücre uzantısı biçimi olarak tipik bir fibroblast benzeri görünüm 1 x 105 hücreleri/iyi göstermek vasıl kaplama ve kümeleri (Şekil 1a ve 1 c) oluşturmak eğilimindedir. Kaplama yoğunluğu tarafından 10 kat artan 1 x 106 hücreler/iyi morfolojisi değişmedi ama daha fazla hücre kümeleri (Şekil 1b ve 1 d, oklar) görülebilir. Zaten gösterildiği gibi bir önceki yayın, kollajen kaplama kültür yemekleri büyük ölçüde hücreleri13eki geliştirilmiş.
İlk dondurma hücre kültürü ile karşılaştırıldığında bu doğrudan taze izole örnekleri kültürlü fizyolojik özellikleri önemli ölçüde değişmedi. Bu Şekil 2 ' de (qPCR tarafından ölçülen) transkript bereket birkaç işaretleyicinin genlerin ne zaman karşılaştırmak kültürlü hücreleri dondurulmuş ya da taze izole havuzlarından türetilmiş farklı değil gösterilir.
Şekil 3 sığır GC normal vs yüksek yoğunluklu kültürlü temsilcisi (RIA tarafından ölçülen) steroid hormon analizi sonuçlarını gösterir. Progesteron üretimi daha yüksek olma eğilimi ise estradiol konsantrasyonunu normal yoğunluk kültüre göre yüksek yoğunluklu kültüründe önemli ölçüde azalır.
Genlerin (qPCR tarafından ölçülen) çeşitli kültürlerde yüksek - vs normal yoğunluk karşılaştırmalı analizi önemli etkisi (Şekil 4) saptandı. CYP19A1anahtar enzim estradiol biyosentezi aromataz yanı sıra gonadotropin reseptör FSHR, kodlama, önemli ölçüde aşağı-düzenlenmiş. Buna ek olarak, RGS2 ve VNN2 genler önemli bir up-regülasyon gösterdi. Bu sonuçlar açıkça hücresel farklılaşma belirli işlemleri yoğunluk kaplama hücre artırarak indüklenir öneririz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Şekil 1: kültürlü sığır granulosa hücreleri normal (sol kapı aynası) ve yüksek hücre yoğunluğu (doğru kapı aynası). 1 x 105 hücreleri/iyi bir yoğunluk kültürlü (a ve c) hücreler tipik bir fibroblast benzeri fenotip görüntülenir. (b ve d) GC büyük hücre kümeleri (oklar) formu eğilimi bir yüksek kaplama yoğunluğuna (1 x 106 hücreler/de) daha sık hücreleri normal yoğunluk (sol panelde) altında karşılaştırıldığında kültürlü. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Şekil 2: yalıtım hemen sonra ve sonra dondurma kültürlü hücreleri karşılaştırılması. Hücreleri de başına 1 x 105 hücre yoğunluğu, kültürlü. Birkaç işaret transkript gen ekspresyonu değerlendirildi ve kültürlü hücreleri ile veya olmadan bir ilk dondurma arasında hiçbir fark ortaya koymuştur. Kutu çizimi n sayılarının gösterir = 3. İki kuyruklu öğrenci t-testi, p-dahil değerlerdir. Bu rakam tekrar Baufeld ve Vanselow16oluşturulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Şekil 3: Steroid hormon konsantrasyonu granulosa hücrelerinde farklı kaplama yoğunlukları kültürlü. Progesteron (P4) konsantrasyon sadece daha yüksek olma eğilimi ise estradiol (E2) toplama ne zaman GC yüksek hücre yoğunluğu kültürlü önemli ölçüde azalmıştır. Hormon konsantrasyonu farklı hücre sayıları için normalize etmek DNA içeriği için giderilmiştir. Ortalama ve SEM n = 3 gösterilir. p > 0.05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam Baufeld ve ark. çoğaltılamaz 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Şekil 4: Kültürlü granulosa hücrelerinde fonksiyonel anahtar transkript bolluk bir normal vs yüksek kaplama yoğunluğu. Sığır GC 8 d için serum serbest koşullarda kültürlü belirli bir düzenleme birkaç seçili marker gen saptandı. Kutu çizimi n sayılarının görüntüler 3 bireysel çoğaltır =. p < 0,05, iki kuyruklu öğrenci t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K Görüntüleme.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Fare Primer Pankreas Asiner Hücreleri İzolasyon ve Kültür

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique tissue important for proper function of the synovial joint and is constituted by a dense extracellular matrix (ECM), rich in proteoglycan and type II collagen. Chondrocytes are the only cell type present within cartilage and are widespread and relatively low in number. Altered external stimuli and cellular signalling can lead to changes in ECM composition and deterioration, which are important pathological hallmarks in diseases such as osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis.
Ex vivo cartilage models allow 1) profiling of chondrocyte mediated alterations of cartilage tissue turnover, 2) visualizing the cartilage ECM composition, and 3) chondrocyte rearrangement directly in the tissue. Profiling these alterations in response to stimuli or treatments are of high importance in various aspects of cartilage biology, and complement in vitro experiments in isolated chondrocytes, or more complex models in live animals where experimental conditions are more difficult to control.
Cartilage explants present a translational and easily accessible method for assessing tissue remodeling in the cartilage ECM in controllable settings. Here, we describe a protocol for isolating and culturing live bovine cartilage explants. The method uses tissue from the bovine knee, which is easily accessible from the local butchery. Both explants and conditioned culture medium can be analyzed to investigate tissue turnover, ECM composition, and chondrocyte function, thus profiling ECM modulation.

Here, we present a protocol describing isolation and culturing of cartilage explants from bovine knees. This method provides an easy and accessible tool to describe tissue changes in response to biological stimuli or novel therapeutics targeting the joint.

Sığır Diz Eksbitkilerinde Kıkırdak Remodeling Ex Vivo Doku Kültür Modeli

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Deniz Hıyar Bağırsak Hücrelerinin Birincil Kültüründe Apoptosis İndüksiyon uyupve tayini

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Domuz Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Primer Kültürü

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...