Biz Veronica Schreiter onun mükemmel teknik yardım ve kurulan dondurma tekniği ve hücre kültür modeli yararlı değişiklikler için teşekkür ederim. Ayrıca, biz gibi Maren Anders ve Swanhild Rodewald daha sonraki analiz onların mükemmel teknik yardım için teşekkür ederim.

Not: Sığır yumurtalıklar ticari bir mezbaha elde edilmiştir. Mezbaha yan topluluğu Alman yasalarına göre etik bir onay gerektirmez.
1. çalışma koşulları ve hazırlıkları
<ol><li>Kısırlık garantilemek için tüm medya gerçekleştirmek ve doku hazırlık yanı sıra tüm kültür bir laminar akış Bank kullanarak bir özel hücre kültür laboratuarda çalışıyorum.</li>
	<li>1 x 100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve yumurtalık taşıtlar için 0,5 µg/µL amfoterisin ile takıma fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7,4) hazırlayın. Not: Bu kurulum içinde 2 h yumurtalık alma ve GC yalıtma arasında maksimal süresi kadardır.</li>
</ol>2. izolasyon sığır Granulosa hücre
<ol><li>
Yalıtım yordamına başlamadan önce yüzeyden herhangi bir kan kaldırmak için yumurtalıklarda birkaç kez 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) yıkayın. Bir ölçek kullanın, yumurtalık içinde yer, 1 x PBS ile doldurun ve PBS tekrar atmak.
	<ol>
<li>Yumurtalık kalan herhangi bir kan temizlenir bu kadar yıkama 3 – 4 x, tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir yumurtalık mümkün contaminations en aza indirmek için % 70 alkol ile batırılmış bir laboratuvar silin kullanarak silin.</li>
	<li>3 mL şırınga ve bir 18 G iğne ile küçük ve orta boyutlu köklerinin delinme tarafından GC Aspire edin (< cetvelle ölçülür 6 mm) ve bir 50 mL santrifüj tüpü foliküler sıvı Havuzu. Not: şırınga nemlendirmek için 1 x PBS (100 IU penisilin, 0.1 mg/mL streptomisin ve 0,5 µg/µL amfoterisin ile) küçük bir miktar alır. Bu Folliküler sıvı az miktarda toplamak için yardımcı olur ve hücre şırınga yapışmasını önler.</li>
	<li>Birkaç köklerinin delinme sonra şırınga ve iğne ara temizlik için 1 x PBS ile yıkayın.</li>
</ol>3. hücre dondurma
<ol><li>
Trypan mavi boyama kullanın ve bir hemasitometre altında hücreleri saymak.
	<ol>
<li>Hücrelerin sayısını saymak için bir tüp ile 1,5 µL % 0,25 trypan mavi çözüm hazırlamak. Not: trypan mavi mavi görünür ölü hücreleri hücre bariyer sadece erişebildiğinden canlı hücreler günahı kalır.</li>
		<li>15 µL granulosa hücre süspansiyon trypan mavi ekleyin ve onları hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Karışımı bir hemasitometre her iki odasında yerleştirin. Yaşam saymak (günahıÖrneğin,) bir büyük kare başına odası hücrelerde. Not: her ne kadar bazı kan hücreleri görülebilir, onlar onların çok küçük boyutuna göre ayrılır.</li>
		<li>Genel esaslarına göre her iki odası kareler ortalaması ile canlı hücreler sayısını hesaplamak; canlı hücreler oranını yumurtalık arasında değişebilir ama %6013aşmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bir örnek daha ayrıntılı bir çözümleme için bir başvuru olarak taze izole granulosa hücre havuzundan al.
	<ol>
<li>İzole GC hücre sayısı bağlı olarak, uygun bir sayı hücre başvuru örnekleri RNA, DNA veya protein hazırlık için bir kenara. Not: sonraki diğer analizleri farklı, genellikle yüksek hücre sayıları gerektirebilir RNA izolasyon sonraki gen ifadesinin değerlendirilmesi için 1 x 105 hücreleri yeterli, olanlardır.</li>
		<li>Bir veya daha fazla aliquots başvuru hücre taze bir tüp içinde yerleştirin ve oda sıcaklığında ve hücre Pelet elde etmek için en yüksek hızı (12.000 x g) 1 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.</li>
		<li>Hemen şok-örnekleri sıvı azot kıpırdama. Örnek-80 ° C'de depolayın</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dondurma aşağıdaki gibi yapın.
	<ol>
<li>Dondurucu orta % 80 fetal buzağı serum (FCS) ve % 20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanarak hazırlayın.</li>
		<li>Yavaşça GC cips için GC için oda sıcaklığında ve 500 x g3 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatli bir şekilde çıkarın ve yavaşça hücreleri resuspend yok daha fazla hücre kadar % 100 FCS (Örneğin, 1 mL) içinde kümeleri görülebilir.</li>
		<li>1 birim (Örneğin, 1 mL) hazır dondurma Orta hücre süspansiyon ekleyin ve karışımı kriyojenik bir şişe aktarın. Not: Soğutucu koruma medya son konsantrasyonu % 90 FCS ve % 10 DMSO olacaktır.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi hızlı donma engelleyen bir uzman (ticari olarak mevcut) dondurma kapsayıcısına getirin. Soğutma hızı örnekleri-1 ° C/dak Transfer dondurma konteyner içine en az 4 h için-80 ° C dondurucu aşmaması gerekir.</li>
		<li>Daha uzun depolama için kriyojenik şişeleri Ultra düşük sıcaklık kaplarda (Örneğin, sıvı faz azot konteynerler) yerleştirin. Not: protokol, burada, dondurma daha uzun depolama sağlar gibi durdurulabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. medya ve kültür plakaları için hazırlanması hücre kültürü
<ol><li>
Hücre kültür plakaları %0.02 kollajen R. ile kat Not: Kollajen R GC geliştirilmiş bir ek olarak kültür için gerekli olduğu bilinmektedir.<ol>
<li>Arıtılmış su hücre kültürü için uygun bir %0.02 kollajen R çözümle hazırlayın.</li>
		<li>İyi ücret 150 µL bir 24-şey tabak içinde eklemek (= 2 cm2/de) ve kültürünün bütün yüzeyi de kolajen R çözüm ile kaplıdır.</li>
		<li>Bir kaç saatliğine açık kapaklı kuru veya laminar akış mahallede bir gecede çözüm ver.</li>
		<li>Kültür plaka tamamen kuru olduğunda, onları kirlenme en aza indirmek 10-15 dk için UV ışığıyla ışınlatayım.</li>
		<li>Gerekirse, plakayı 4 ° C'de 2 aya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medya ve kültür iş laminar akış başlık altında için ek hazırlamak. GC başarılı bir kurtarma için onlar hemen çözdürme sonra işlenmek üzere var.</li>
	<li>
Aşağıdaki ortam hazırlamak.
	<ol>
<li>2 mM L-glutamin, %0.084 sodyum bikarbonat, % 0,1 sığır serum albumin (BSA), 20 mM HEPES, 4 ng/mL Sodyum selenit, 5 µg/mL transferrin, 10 ng/mL insülin ve 1 mM esansiyel olmayan amino asitler ile α-Minimal gerekli ortam (α-MEM) ek.</li>
		<li>Ayrıca, 100 IU penisilin ve 0.1 mg/mL streptomisin ortamına Ekle. Not: bir kez ısındı, antibiyotikler, yaklaşık 48 saat için stabildir. Bu nedenle, aliquot kültür set-up için medya ve planlanan medya istenilen miktarda Döviz. Yalnızca medya aliquots 37 ° c su banyosu içinde önceden ısıtmak. Hazırlanan medya artık 3 aydan fazla için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Steroid kültürlü sığır GC etkinliğinde ikna etmek için α-MEM Ayrıca 20 ng/mL folikül - uyarıcı hormon (FSH) ile 50 ng/mL R3 IGF-1 ve 2 µM androstenedion takviyesi. Not: Her zaman kısa bir süre önce bir kültür veya ortam değişimi başlangıcı bu bileşenler ek. Bu steroid etkinlik tehlikeye atabilir FSH ve IGF-1 hisse senedi çözümleri için tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. hücre kültür çalışma
<ol><li>Hücreleri hızlı bir şekilde su banyosu için 3-4 dk 37 ° C'de erimek ve hücre süspansiyon 37 ° C önceden ısıtılmış α-MEM (olmadan hormon takviyesi) içine aktarın. Santrifüjü için son hacmi 10 mL önerilir.</li>
	<li>3 dakika oda sıcaklığında ve 500 x gde GC santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak. Önceden ısıtılmış ve desteklenmiştir α-MEM ekleyin ve hücreleri dikkatle resuspend.</li>
	<li>Tohum GC, 1 x 105 veya iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğu son hacmi 500 µL. Teknik çoğaltır koşul başına en az üç kültür Wells içerir.</li>
	<li>8 d için bir kuluçka-37 ° c % 5 CO2 hücre kültüründe kuluçkaya.</li>
	<li>Ortam değişimi her geçen gün gerçekleştirmek. Sadece üçte iki kültür ortamının stresi azaltmak için ve taze medya hücrelere uyarlaması kolaylaştırmak için değiştirin. Not: GC kültür birkaç gün sonra tipik bir fibroblast benzeri fenotip oluşturmak ve birlikte küme eğilimindedir. Yüksek hücre yoğunluğu kültüründe daha büyük kümeler normal yoğunluk GC Kültür (Şekil 1, doğru kapı aynası sol vs ) ile karşılaştırıldığında daha sık bulunmuştur.</li>
</ol>6. daha sonraki analiz kültürlü Granulosa hücre
<ol><li>Steroid hormon analizi gerçekleştirmek için ortam toplamak ve -20 ° C'de dondurmak Harcanan medya [Örneğin, radioimmunoassay (RIA)]14östradiol ve progesteron konsantrasyon çözümlemek için uygun yöntemleri kullanın.</li>
	<li>Farklı hedef molekülleri (RNA, DNA, protein vb.)sonraki analiz için uygun bir lysing Ajan ile kültür çanak doğrudan hücrelerde tedarikçi tarafından önerildiği gibi koşullar. Not: lysed hücreleri-20 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir çoğu yalıtım yordamları için burada, protokolü durdurmak mümkündür. Daha uzun depolama için hücreleri-80 ° C'de tutulmaları gerekir</li>
	<li>Transkript bereket belirlemek, cDNA sentez ve nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) teknikleri15tarafından belirli transkript ölçmek için. İstatistiksel değerlendirme farklı hücre kültürleri, farklı hücre hazırlıkları (biyolojik çoğaltır) kökenli en az üç çoğaltmalar içermelidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro.">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li><li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture.">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li><li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex.">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li><li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+resource:+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes.">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li><li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+granulosa+cell+lines.">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li><li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation.">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li><li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells:+protein+secretion,+steroid+metabolism,+and+responsiveness+to+growth+factors.">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li><li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system:+induction+and+maintenance+of+estradiol+production,+response+to+follicle-+stimulating+hormone,+and+morphological+characteristics.">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li><li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media.">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li><li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell,+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited.">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li><li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro.">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li><li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells.">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells.">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li><li>Schneider, F., Br&#252;ssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts.">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li><li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density.">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li><li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage.">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15 (2018).</li><li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions.">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li><li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells.">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li><li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period.">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan hücre kültür modeli granulosa hücre farklılaşması içinde vitroanaliz etmek için bir araç sağlar. Çeşitli çalışmalarda serum-Alerjik ekimi kültürlü sığır GC veya diğer türler8,9GC steroid etkinliğini korumak için bir ön koşul olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre dışı matriks (Örneğin, kollajen R)13bileşenleri ile kültür çanak kaplama, ekin hücrelerin belirgin bir biçimde iyileştirilmiş. Bir diğer önemli özelliği uzun süreli kültür dönemdir. Son zamanlarda, uzun vadeli bir kültür yeterli steroidogenic etkinliği ve granulosa hücre kimlik işaretleri17dengeli bir ifade elde etmek gerekli olduğunu kanıtlanmıştır. Görünüşe göre GC yalıtım işlem sırasında fiziksel stresten kurtarmak için zaman gerektirir.
FSH, IGF-1 ve androstenedion aromataz etkinliğinde ikna etmek için bilinen medya takviyeleri GC kültürlü. Özellikle, ile androstenedion takviyesi kesinlikle gereklidir GC olarak bir habercisi estradiol sentezi için gerekir. Bu oldu daha önce11,18 yayınlandı ve bu nedenle, daha fazla çalışmanın sırasında soruşturma değil. Ancak, FSH, IGF-1 ve androstenedion konsantrasyonları bir uyarlaması deneysel diğer set-up için gerekli olabilir.
Burada açıklanan dondurma tekniği yanında yapım onları daha yumurtalık ile değişen kaynağından bağımsız doku kültürü deneyleri organizasyonu geliştirmeye yardımcı olabilir. Önceki test göre dondurma GC fenotip veya steroid kültür üretiminde etkilemez. Ayrıca, işaretleyici transkript kültürlü hücrelerdeki bereket önemli farklılıklar taze izole hücreler bu daha önce dondurma16için tabi ile hazırlanan örnekleri karşılaştırma olmadığını göstermiştir.
Mevcut GC kültür modeli için çok önemli bir parametre yoğunluğu kaplama hücredir. Temsilcisi sonuçlarıtarafından gösterildiği gibi kaplama yoğunluğu artan fizyolojik ve moleküler özellikleri dikkat çekici değişiklikler indüklenen. Çeşitli genler LH stimülasyon vivo içinde4,19tarafından indüklenir değişiklikleri benzeyen belirli bir şekilde düzenlenmiştir. Artan bir hücre yoğunluğu kültürlü sığır GC farklılaşma benzeri işlemler sürebilirim aslında titizlikle bu GC vitro modelde çoğaltır arasında çakışan sonuçları önlemek için dikkate alınması gereken vardır. Bu nedenle, diğer çalışmalar çelişkili sonuçlar için farklı hücre yoğunluğu atfedilen ve daha yakından incelenmesi gerekir.
Açıklanan kültür modeli algılama sınıra yakın reseptör LHCGR transkript bir çoğu burada ortaya LH için olmayan duyarlı olmak. Bu nedenle, hem LH dalgalanma bir simülasyon vivo içinde durum farklılaşma13ikna etmek başarısız oldu. Yine de, bu modeli estradiol aktif GC birincil kültür eğitim için yararlı bir araç sağlar, şu anda özellikle kadar hayır fonksiyonel sığır GC satır yok.
Farklı tedavi protokollerinin steroid üretim ya da GC farklılaşma düzenleyici mekanizmaları çözmeye yardımcı mevcut GC kültür modeli test edilebilir. Gelişim süreçlerinde söz konusu daha fazla, tek etkenler ayrı ayrı analiz edilebilir. Bu nedenle, bu kültür model birçok farklı uygulama için bir temel sağlar.

Farklı somatik foliküler hücre tipleri ince ayarlanmış ve iyi orkestra moleküler değişiklikler başarılı yumurtlama ve luteinization bağlıdır. Bu gelişim süreçleri ayrıntılarını tam olarak henüz anlaşılır değil beri daha fazla açıklama gereklidir. Vivo yaklaşımlar ayrıntılı ve pahalı ve özellikle, folliculogenesis sırasında ortaya çıkan adresi belirli moleküler mekanizmaları için başarısız. Bu nedenle, reductionistic vitro modelleri Ayrıca, hücresel ve moleküler ayrıntıları içgörü sağlamak için ihtiyaç vardır. Farklı çalışmalar Kültür bağlamında vitro fertilizasyon teknikleri1,2,3, Bütün köklerinin açıklar. Araştırmacılar farklılaşma mekanizmalar baktılar olduğundan, birçok çalışma foliküler GC üzerinde odaklanın. Bu hücreler, oosit ile doğrudan ilişkili östrojen üretiminin önemli kaynaklarıdır ve böylece, folliculogenesis ve luteinization4boyunca önemli bir rol oynamaktadır.
GC satırlarının farklı türlerden geliştirilmiştir hücre ölümsüzleştirdi. Bunların çoğu, ancak, yeterli bir steroid hormon üretimi5göstermek değil. Şimdiye kadar sadece bir telefon hattı GC oldu sığır6kurulan ama bu satırı steroidogenic faaliyete çeşitli pasajlar7' den sonra kaybetti. Bu nedenle, steroidogenesis beri ve özellikle de, estradiol üretim GC işlevlerin gerekli bir özelliktir, bu yönleriyle birincil hücre kültür modelleri incelemek için tavsiye edilir. Önceki çalışmalarda önemli estradiol üretim sadece serum serbest kültür koşulları8,9altında üremesini gösterilmiştir. GC başarısız olarak progesteron androstenedion10' a çevirmek için gerekli enzim ifade etmek daha fazla, estradiol sentez habercisi takviyesi başka bir, ön koşuldur. Ayrıca, FSH ve IGF-1 takviyesi vitro sinerjik etkisi aromataz, estradiol sentez11anahtar enzim en iyi duruma getirilmiş bir aktivite saptandı. Mevcut iletişim kuralında, GC kültür model üzerinde önemli bir etkiye sahip diğer önemli faktörler ayrıca açıklanmıştır. Özellikle, yoğunluk kaplama hücre12deneme sonucu üzerinde çok büyük etkileri vardır. Ayrıca, önemli ölçüde GC Fizyoloji kültür engel sığır GC dondurma tekniği oluşturulabilir. Bu teknik hücre kültür iş organizasyonu geliştirmeye ve tercih edilen kaplama yoğunluğu optimize etmek için yardımcı olur.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>penicillin / streptomycin (10,000 IU / 10,000 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>amphotericin (250 &amp;micro;g/mL)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>3 mL syringe (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G needle</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>cryo-preservation vials (2 mL)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX cell freezing container</td><td>Corning</td><td>432004</td><td></td></tr><tr><td>culture dish, 24-well, flat bottom</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>collagen R (0.2 %)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>sodium selenite</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>dissolved in sterile water</td></tr><tr><td>insulin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>dissolved in 1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>originally purchased at Biochrom AG that is now part of the Merck-Millipore Company; the Cat.-No of Biochrom still exists</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>we prefer to use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, diluted in 0.9 % NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>we use a stock solution of 2 &amp;micro;g/mL, dissolved in 10 mM HCl and 1x PBS with 1 mg/mL BSA</td></tr><tr><td>androstenedione</td><td>Sigma</td><td>46033</td><td>we use a stock solution of 10 mM, diluted in 100 % ethanol</td></tr></tbody></table>

a tissue culture model of estrogen-producing primary bovine granulosa cells

Yumurtalık granulosa hücreleri (GC) estradiol sentez önemli kaynağıdır. Preovulatory luteinizan hormon (LH) dalgalanma tarafından indüklenen, hücreleri granulosa ve, özellikle, granulosa hücre katmanı derinden onların morfolojik, fizyolojik ve moleküler özelliklerini değiştirmek ve progesteron üretimi gövde formu luteum gebelik bakımından sorumludur. Hücre kültür modelleri temel düzenleyici mekanizmaları folliculo luteal dönüşüm içinde yer alan eğitim için gerekli araçları vardır. Yalıtım yordam ve köklerinin (< 6 mm) küçük ve orta boyutlu dan bovine GC dondurma sunulan Protokolü odaklanır. Bu teknik ile GC neredeyse saf nüfusu elde edilebilir. Dondurma işlemi büyük ölçüde zaman hücre kültürü yönetiminin bağımsız olarak doğrudan birincil doku (yumurtalık) tedarik kolaylaştırır. Bu iletişim kuralı sığır GC estradiol aktif durumunu taklit eden bir serum serbest hücre kültür modeli açıklar. Başarılı steroid-aktif hücre kültürü için gerekli olan önemli koşulları boyunca protokolünün ele alınmıştır. Hücreleri kaplama yoğunluğu artan belirli bir tepki bir değişmiş gen ifade profil ve hormon üretimi tarafından belirtildiği şekilde indükler gösterilmiştir. Ayrıca, bu modeli daha da GC farklılaşması üzerine çalışmalar için bir temel oluşturur ve diğer uygulamaları sağlar.

GC fibroblastlar için karşılaştırılabilir bir hücre uzantısı biçimi olarak tipik bir fibroblast benzeri görünüm 1 x 105 hücreleri/iyi göstermek vasıl kaplama ve kümeleri (Şekil 1a ve 1 c) oluşturmak eğilimindedir. Kaplama yoğunluğu tarafından 10 kat artan 1 x 106 hücreler/iyi morfolojisi değişmedi ama daha fazla hücre kümeleri (Şekil 1b ve 1 d, oklar) görülebilir. Zaten gösterildiği gibi bir önceki yayın, kollajen kaplama kültür yemekleri büyük ölçüde hücreleri13eki geliştirilmiş.
İlk dondurma hücre kültürü ile karşılaştırıldığında bu doğrudan taze izole örnekleri kültürlü fizyolojik özellikleri önemli ölçüde değişmedi. Bu Şekil 2 ' de (qPCR tarafından ölçülen) transkript bereket birkaç işaretleyicinin genlerin ne zaman karşılaştırmak kültürlü hücreleri dondurulmuş ya da taze izole havuzlarından türetilmiş farklı değil gösterilir.
Şekil 3 sığır GC normal vs yüksek yoğunluklu kültürlü temsilcisi (RIA tarafından ölçülen) steroid hormon analizi sonuçlarını gösterir. Progesteron üretimi daha yüksek olma eğilimi ise estradiol konsantrasyonunu normal yoğunluk kültüre göre yüksek yoğunluklu kültüründe önemli ölçüde azalır.
Genlerin (qPCR tarafından ölçülen) çeşitli kültürlerde yüksek - vs normal yoğunluk karşılaştırmalı analizi önemli etkisi (Şekil 4) saptandı. CYP19A1anahtar enzim estradiol biyosentezi aromataz yanı sıra gonadotropin reseptör FSHR, kodlama, önemli ölçüde aşağı-düzenlenmiş. Buna ek olarak, RGS2 ve VNN2 genler önemli bir up-regülasyon gösterdi. Bu sonuçlar açıkça hücresel farklılaşma belirli işlemleri yoğunluk kaplama hücre artırarak indüklenir öneririz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> Şekil 1: kültürlü sığır granulosa hücreleri normal (sol kapı aynası) ve yüksek hücre yoğunluğu (doğru kapı aynası). 1 x 105 hücreleri/iyi bir yoğunluk kültürlü (a ve c) hücreler tipik bir fibroblast benzeri fenotip görüntülenir. (b ve d) GC büyük hücre kümeleri (oklar) formu eğilimi bir yüksek kaplama yoğunluğuna (1 x 106 hücreler/de) daha sık hücreleri normal yoğunluk (sol panelde) altında karşılaştırıldığında kültürlü. Ölçek çubukları 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> Şekil 2: yalıtım hemen sonra ve sonra dondurma kültürlü hücreleri karşılaştırılması. Hücreleri de başına 1 x 105 hücre yoğunluğu, kültürlü. Birkaç işaret transkript gen ekspresyonu değerlendirildi ve kültürlü hücreleri ile veya olmadan bir ilk dondurma arasında hiçbir fark ortaya koymuştur. Kutu çizimi n sayılarının gösterir = 3. İki kuyruklu öğrenci t-testi, p-dahil değerlerdir. Bu rakam tekrar Baufeld ve Vanselow16oluşturulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> Şekil 3: Steroid hormon konsantrasyonu granulosa hücrelerinde farklı kaplama yoğunlukları kültürlü. Progesteron (P4) konsantrasyon sadece daha yüksek olma eğilimi ise estradiol (E2) toplama ne zaman GC yüksek hücre yoğunluğu kültürlü önemli ölçüde azalmıştır. Hormon konsantrasyonu farklı hücre sayıları için normalize etmek DNA içeriği için giderilmiştir. Ortalama ve SEM n = 3 gösterilir. p > 0.05, iki kuyruklu öğrenci t-test. Bu rakam Baufeld ve ark. çoğaltılamaz 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> Şekil 4: Kültürlü granulosa hücrelerinde fonksiyonel anahtar transkript bolluk bir normal vs yüksek kaplama yoğunluğu. Sığır GC 8 d için serum serbest koşullarda kültürlü belirli bir düzenleme birkaç seçili marker gen saptandı. Kutu çizimi n sayılarının görüntüler 3 bireysel çoğaltır =. p < 0,05, iki kuyruklu öğrenci t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells at JoVE.com

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

9.1K Görüntüleme.  Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN). Uzun vadeli bir kültür model sığır granulosa hücre serum-Alerjik koşullar altında açıklanmıştır. Araştırmacılar farklı kaplama yoğunlukları östrojen üretimi ve özellikleri olarak etkileri çeşitli faktörler ve koşulları incelemek bu modeli verir sığır granulosa hücreleri.

Video: A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Üç boyutlu heterotipik<em&gt; In Vitro</emYumurtalık Kanseri Başlatma ve İlerleme sırasında Stromal-Epitel Etkileşimleri&gt; Modelleme

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Tıp

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Gelişim Biyolojisi

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is limited to cell proliferation and gene expression endpoints. However, in the organism, mammary morphogenesis occurs in a 3D environment. 3D culture systems help bridge the gap between monolayer cell culture (2D) and the complexity of the organism. Herein, we describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action. It uses the commercially available hormone-responsive human breast epithelial cell line, T47D, and rat tail collagen type 1 as a matrix. This 3D culture model responds to the main mammotropic hormones: estradiol, progestins and prolactin. The influence of these hormones on epithelial morphogenesis can be observed after 1- or 2-week treatment according to the endpoint. The 3D cultures can be harvested for analysis of epithelial morphogenesis, cell proliferation and gene expression.

We describe a 3D culture model of the human breast epithelium that is suitable to study hormone action.

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Biyomühendislik

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

3 Boyutlu Sığır İleal Enteroid Kültüründen 2 Boyutlu Monotabaka Oluşturulması

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

Yazar Spotlight: Konak-patojen etkileşimlerini incelemek için gelişmiş enteroid model 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üç boyutlu heterotipik

Mouse ovarium olayları görselleştirmek için yumurtalık doku kültürü

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

İnsan Meme Bezi Epitelinin Bir Hormon duyarlı 3D Kültür Modeli

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Sığırlarda Erken Antral Folikülden Oositler Için Tüp Bebek Kültür Stratejisi

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması