Bu yöntem pulmoner hipertansiyonda intimal proliferasyon mekanizmalarının moleküler yolu gibi pulmoner vasküler araştırma alanındaki temel soruların ele alınmasına yeni bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu yöntemin en büyük avantajı, hastaya ek risk olmadan pulmoner vasküler endotel bir dakikalık hücresel biyopsi sağlamasıdır. Prosedürü gösteren bayan Reina Perez, Klinik Koordinatörümüz ve Dr. Phillip Gallo, laboratuvarımda müdür olacak.
Kateter kılıftan çekildikten sonra, hemen 40 mililitre soğutulmuş steril salin içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne batırın. Herhangi bir kan kaldırmak için kateter birkaç kez girdap, ve içinde tutulan kan kaldırmak için gerekirse hattı floş. Kateter ucunun beş santimetrelik distal'ını kesin ve santrifüj tüpüne düşmesine izin verin.
Hemen ucu kaldırmak için terpler kullanın ve endotel hücre büyüme orta 15 mililitre içeren 15 mililitre centrifuge tüp aktarın. Sonra, tüpü mühürle. Tüpü buza yerleştirin ve laboratuara aktarın.
Ya numuneyi hemen işlayın ya da işlemin gerçekleşeceği laboratuvara gece nakliyesi için numuneyi ıslak buza yerleştirin. Balonun ortama daldırılmış olarak kalması çok önemlidir. Bu yüzden endotel hücre büyüme ortamı ile tamamen doldurarak 15 mL tüp minimal kafa boşluğu olduğundan emin olun.
İlk olarak, temiz bir 15 mililitre santrifüj tüp hücre ayırma çözeltisi beş mililitre ekleyin. Bu tüpü buza koy. Bir mililitreşli şırınga kullanarak, başucu toplama tüpünde kalanlardan bir mililitre endotel hücreli ortam çekin.
Bir mililitrelik şırınganın iğnesini kılavuz telin karşısındaki beyaz deliğe dikkatlice yerleştirin. Kateter ucunu hücre ayırma çözeltisini içeren 15 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin. Yaklaşık 200 mikrolitre medya ile balonu şişirin, patlamamaya dikkat edin.
Tüpü buza yerleştirin ve kateterin balon şişirilmiş olarak beş dakika hücre ayırma çözeltisinde oturmasına izin verin. Bundan sonra, balonun hücre ayırma çözeltisinin bu birikintisine yerleştirildiğinden emin olmak için tüpün içindekileri 100 milimetrelik bir tabağa dökün. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişirilmiş balon kazıyın, kateter karşılayan balonun kutupları odaklanmak.
Ardından, hücre kazıyıcının balonun tüm yüzeyine en az iki kez temas edeceğinden emin olun ve hücre ayırıcısını hücre ayırma çözümünde düzenli olarak durulayın. Balonu söndürün ve fırçalama hareketi ile kazıyın. Daha sonra hücre kazıyıcısını hücre ayırma çözeltisinin birikintisinde durulayın.
Kateter ucunu, iğneyi ve hücre kazıyıcıyı uygun bir atık kabına atın. Hücre hasatını içeren hücre ayırma çözeltisini 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne dökün. Toplama tüpünü sallayın ve ondan kalan ortamı toplanan örneğe de dökün.
Numuneyi 650 kez G ve 4 santigrat dereceyi 10 dakika santrifüj edin. Aspirasyon medya, rahatsız etmemek veya pelet aspire dikkatli olmak. Soğutulmuş kırmızı kan hücreli lysis çözeltisi bir miliiter pelet resuspend ve 1.5 mikrolitre santrifüj tüp bu süspansiyon aktarın ve yavaşça 10 dakika boyunca dört derece santigrat tüp kaya.
Tüpü 500 kez G'de santrifüj edin, ve dört santigrat dereceyi beş dakika boyunca. Sonra kırmızı kan hücresi lysis çözeltisi aspire. PBS, FcR bloker ve anti-insan CD-146 mikroboncuklar içeren bir çözelti içinde pelet resuspend.
15 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yat. Soğutulmuş PBS bir mililitre ekleyin. 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj.
Supernatant aspire ve soğutulmuş PBS bir mililitre pelet resuspend. Ardından, oda sıcaklığında manyetik bir rafa manyetik LS sütunu yerleştirin. Bir mililitre PBS ekleyerek ve tüm hacmin akmasını sağlayarak sütunu asal.
Akışı atın. Örneği manyetik kolona yükleyin ve akışı atın. Her yıkama için üç mililitre soğutulmuş PBS kullanarak sütunu üç kez yıkayın.
Tüm bu akışı atın. Sonra 15 mililitrelik bir santrifüj tüp soğutulmuş PBS üç mililitre ekleyin. Mıknatıs sütunundan raftan çıkarın ve PBS'yi tüpten sütuna dökün.
Hızlı bir şekilde akış yakalamak için santrifüj tüp içine sütun yerleştirin. Hemen sütun ile birlikte piston ile dalma. Örnek şimdi saflaştırılmış ve fiksasyon, boyama veya kültür için hazır.
Bu çalışmada sağ kalp kateterizasyonu ndan sonra hücreler Kuğu-Ganz kateter uçlarından arındırılmış. Bu hücreler CD-146 seçim sütununa bağlanır ve kültürlü birincil insan pulmoner arter endotel hücrelerinden ayırt edilemeyen ileri ve yan dağılım profillerine sahiptir. Kateter balonu sadece tanıtıcı kılıf, pulmoner arter damar duvarı ve kan ile fiziksel temas halinde olduğundan ve hücrelerin kandan türediği gösterildiği için pulmoner arter damar duvarından türetildiği varsayılmaktadır.
İşlemin ardından hasat edilen hücreler akış sitometrisi, qPCR, sıralama ve proteomix gibi çeşitli yöntemlerle analiz edilebilir. Hücre verimleri konvansiyonel Batı leke için çok düşük, ancak düşük giriş lilotlama metodolojileri düşünülebilir. Hücreler kültüre alınabilir, ama bu çok zordur ve her zaman bizim elimizde başarılı olmaz.
Kültür denenecekse, hastadan kapasit ucunun toplanması ile son saflaştırma ve kaplama adımları arasındaki aralığı en aza indirmek ve yöntemin tüm işleme adımları boyunca numunenin soğuk tutulmasını sağlamak önemlidir. Bu protokolün insan kanı ve dokuyla çalışmayı içerdiğini unutmayın. Evrensel önlemlere uyulmalıdır.
Özellikle, protokolün bir adım erken kateter ucunun kesik ucuna keskin bir iğne takılması hastanın kanıyla kontamine olmuş bir adım vardır. Bir iğne çubuğu riskini önlemek için kateter ucunun parmaklarınızla değil, bu adımda hemostatlarla tutulması gerektiğini asla unutmayın.
