Bu yöntem, anti-androjenik bileşiklerin endometriotik lezyonların boyutu üzerindeki etkileri gibi endometriozis alanındaki terapötik ilaç etkilerinin değerlendirilmesinde anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, spesifik ilaçların etkilerinin son noktadan ziyade gerçek zamanlı olarak endometriozisin hayvan modellerinde değerlendirilebiliyor olmasıdır. Prosedürü gösteren Jessica Martinez, benim laboratuvarbir teknisyen, yanı sıra Viviana Bisbal ve Nerea Marin, Centro de Investigacion Principe Felipe veterinerler ve ekibimiz ile yakın işbirlikçileri vardır.
İmplant ameliyatından 2-3 gün önce, durulanmış, sağlıklı endometrial doku biyopsi si parçalarını tam orta içeren 10 santimetrelik Petri kabına aktarın ve dokuyu 5 ila 10 milimetreküp küp parçalara dönüştürmek için neşterler kullanın. Bir mikropipet kullanarak, yeni bir 10 santimetrelik kültür çanak altında DMEM 30 ila 50 mikrolitre damla ekleyin, böylece birbirleriyle temas gelmez her damla arasında yeterli boşluk bırakarak. Tüm damlalar yerleştirildiğinde, her damla içine biyopsi doku parçası tek bir parça yerleştirmek için bir şırınga iğnekullanın.
Daha sonra, doku parçası başına 96 kuyu plakası bir kuyuya taze hazırlanmış adeno-mCherry 100 ila 200 mikrolitre ekleyin, artı negatif kontrol olarak adenovirüs içermeyen DMEM ile üç kuyu. Daha sonra 37 santigrat derece ve% 5 CO2 bir gecede kuluçka için adeno-mCherry çözeltisi her kuyuiçine bir doku örneği aktarmak için iğne kullanın. Ertesi sabah bir floresan mikroskop aşamasında plaka yerleştirin ve optimum etiketleme için parçaları kontrol etmek için 568 nanometre lazer kullanın.
MCherry adenovirüs enfekte uygun seyreltme kullanarak dokunun etkili bir etiketleme için anahtardır. Bu nedenle uygun konsantrasyonu belirlemek için, her bir deney için mCherry seyreltme için birkaç, değerlendirilmesi gerekir. Daha sonra en parlak parçaları taze, eksiksiz orta içeren yeni bir 96 kuyu plakasının tek tek kuyularına aktarın.
Ooforektomiden en az yedi gün sonra, endometriyal doku parçalarını petri kabına ayırın ve anestezili oophorectomized bir hayvanda ayak ucuna yanıt eksikliğini doğrulayın. Supine pozisyonda fare ile ventral alanı dezenfekte ve karın bir 1.5 santimetre uzunlamasına kesi yapmak. Kas dan cilt ayırın ve periton boşluğuna erişmek için kas ikinci bir 1.5 santimetre kesi yapmak.
Mini-forceps ile karın kas duvarının sol kenarı tutarak, hayvanın dışında periton iç yüzünü ortaya çıkarmak için kas katlayın. N-butil ester siyanoakrilat yapıştırıcısında bir endometrial implantı kısa bir süre ıslatmak ve parçayı periton'a bağlamak için mini cımbız kullanın. Yapıştırıcı kurutulduğunda, az önce gösterildiği gibi peritonun kontralateral tarafına ikinci bir implant yerleştirin.
Kas tabakasını kapatmak için emilebilir bir 6-0 sütür ve cildi kapatmak için emilemez 6-0 dikiş kullanın. Daha sonra deri kesisini antiseptik solüsyonla temizleyin ve hayvanı tam recumbency'ye kadar izleyerek iyileşme bölgesine yerleştirin. İmplante edilen doku parçalarının in-vivo floresan görüntülemesi için, implantasyon ameliyatından 24 ila 48 saat sonra in-vivo görüntüleme sistemini açın, yazılımı başlattırın ve CCD kameranın birkaç dakika soğumasını bekleyin.
Cihaz hazır olduğunda ilk anestezili fareyi in-vivo görüntüleme sistemi kafesine, supine pozisyonunda, başı anestezi makinesine bağlı bir borunun içine yerleştirin ve kapağı kapatın. Ardından edinme'yi tıklatın ve elde edilen beş görüntüyü kaydedin. In-vivo floresan ölçmek için, uygun görüntü analizi yazılımı göz atın ve analiz edilecek ilgi karıştırılmamış dosyaseçin.
Yeni bir pencere görüntülenir. Her hayvanın karışık olmayan tüm dosyalarını farklı zaman noktalarında eklemek için listeye ekle'yi tıklatın ve grup olarak yükle'yi tıklatın. Tüm görüntüler tek bir sırayla görünmelidir.
Araç paleti penceresinde, tüm görüntüleri aynı ölçekte ayarlamak için tek tek ölçek onay kutusunu seçin ve dizinin bir resmine çift tıklayın. İlgi çekici bir bölge oluşturmak için, ilgi alanları nın araçları kontur ve otomatik bir seçeneklerini seçin ve daire şeklini tıklayarak daireyi floresan sinyalin ortasına yerleştirin. İlgi alanı oluşturmak için oluştur'u tıklatın ve ilgi çekici bölgeyi sinyal inolmadığı bir arka planda kopyalayıp yapıştırın.
Ardından ilgi çekici bölgeleri ölçü'ye tıklayın ve her bölgenin floresan yoğunluğuna yönelik değerleri görüntülemek için tümünü seçin ve bu değerleri bir elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın. Endometrial parçaların etiketlemesi, enfekte olmayan endometrial doku otofloresansına göre önemli ölçüde daha sağlam olan yakın kızılötesi bölümde floresan yayan bir protein olan mCherry'yi ifade etmek için tasarlanmış adenovirüs ile enfeksiyon la elde edilir. İzleme sırasında, mCherry için referans dalga boyuna ek olarak, floresan görüntüler uyarma emisyon dalga boyu filtreleri farklı çiftleri ile alınır.
Arka plandaki lezyonların karakteristik floresan doku emisyon profillerini ve konak dokular tarafından yayılan otofloresanları tanımlamak için, hayvanların her zaman noktasında yaydığı ham floresan içeren izleme görüntüleri tek bir dosyada bir araya getirilir, normalleştirilmeecektir. Daha sonra, floresan karışık değil, normalleştirilmiş ve yanlış renkli bir görüntü olarak temsil edilir ve belirli lejyon ve arka plan sinyallerine karşılık gelen ilgi alanları otomatik olarak program tarafından tanınan ve ölçülür. İlgi sinyalizasyon arka plan bölgesi ilgi sinyallejyon bölgesinden çıkarılır.
Ve her zaman noktasındaki yoğunluğun sonuçları, yoğunluğun maksimal olduğu zaman noktasına göre normale döner. Birkaç hafta süren izlemeden sonra, uygun implantlar daha fazla alt analiz için geri kazanılabilir. Bu prosedürü çalışırken, dokunun canlılığından ödün vermeden en parlak sinyali sağlayan Ad-mCherry konsantrasyonunun seçiciliğini seçmek önemlidir.
Bu işlemden sonra lezyonlar kurtarılabilir ve ek ayırt edici parametrelerin incelenmesinde kullanılabilir. Bu işlem ksenogreft insan endometriozis lezyonlarının non-invaziv takibi için optimize edilebilmektedir. Ancak, bir ksenogreft siteleri üzerinde ilgi belirli bir ilaçların etkilerini değerlendirmek için kolayca gerçek zamanlı olarak adapte edilebilir.
