Bu yöntem, MSR-1, AMB-1 ve MS-1 adı verilen üç farklı manyetotaktik bakteri türü yetiştirmeyi sağlar. Tüm tatlı su türleri, ve tüm cins manyetospirillum. Bu organizmalar içeren tekrarlanabilir araştırma her türlü için önemli bir ilk adımdır.
Manyetotaktik bakterilerin çok özel oksijen gereksinimleri vardır, bu yüzden manyetik bir navigasyon sistemi geliştirdiler. Bu nedenle onlara mevcut oksijen miktarını kontrol etmek çok önemlidir. Tüm bu protokol tatlı su manyetospirilla birkaç özel suşları için optimize edilmiştir.
Detayları diğer manyetotaktik bakterilerin oksijen ve besin gereksinimlerini karşılamak için optimize edilebilir. Azot istasyonunu kurmak için yeterli alan bulunan bir bankın yakınına güvenli bir şekilde bir nitrojen gazı tankı kurun. İstasyonun inşa edileceği alana ulaşacak kadar uzun bir boru parçasını tanka bağlayın.
Gerekirse, herhangi bir sızıntıyı önlemek için tankın çıkışına Teflon bandı uygulayın. Aynı anda orta beş şişe köpüren yeteneğine sahip bir istasyon inşa etmek için, uzunluğu yaklaşık beş santimetre boru dört adet kesti. Üç adet T şeklindeki plastik bağlantı parçaları ile bir çizgi de boru parçaları monte edin.
Bu hattın bir ucunu ekstra T şeklinde bir montaj ile azot tankının çıkışındaki boru parçasına bağlayın. Diğer uça 90 derecedirsek takılması ekleyin. Yapıyı tezgahın 30 santimetre yukarısına yerleştirilmiş yatay bir metal çubukla takmak için bant kullanın.
20 santimetre uzunluğundaki beş adet boruyu, monte edilmiş bağlantı parçalarının üç çıkışına bağlayın. Beş adet mililitrelik plastik şırıngadan pistonları çıkarın ve bu şırıngaların daha büyük ucunu kesin, sadece mezun olan kısmı tutarak. Çok sıkı paketi değil dikkat, pamuk ile bu şırıngalar doldurun.
Şırıngaları 20 santimetre uzunluğundaki dikey boru parçalarına yerleştirin. Gazı açın ve azot akarken sızıntı olmadığından emin olmak için sabunlu su kullanın. Beş adet 25 gauge iğnenin kapaklarını çıkarın ve bu iğneleri 10 santimetrelik ince boru parçalarına yerleştirin.
Hazırlanan iğneleri azot istasyonunun şırıngalarına takın. Nitrojenin beş hat boyunca aktığından emin olun ve istasyonu beklemede tutun. 100 mililitre distile deiyonize suya 0,245 gram ferrik sitrat ekleyerek 10 milimolar ferrik sitrat çözeltisi hazırlayın.
Isı ve portakal berraklığında bir çözelti elde edilene kadar eritmek için karıştırın. Sterilize stok çözeltisini karanlıkta oda sıcaklığında depolamadan önce 121 santigrat derecede en az 15 dakikalık pozlama standart bir döngü kullanarak çözeltiyi otomatik klavlayın. MSR-1 için beş şişe sıvı büyüme ortamı hazırlamak için, metin protokolünde listelenen kimyasalları 300 mililitre distile deiyonize su içeren bir kabına ekleyin.
Steril ferrik sitrat ve mineral çözeltilerinin ilavesi steril teknikler kullanılarak Bunsen brülörünün ateşi altında yapılmalıdır. Kültürün diğer bakteri türleri tarafından kirlenmesini önlemek için steril koşullar gereklidir. Tüm kimyasalların eklenmesinden sonra, bir molar sodyum hidroksit çözeltisi ile pH'ı 7.0 olarak ayarlayın.
Her şişeye 60 mililitre orta litre dökerek, taze hazırlanmış ortamı 125 mililitrelik serum şişelerine dağıtın. Kabarcık azot 30 dakika boyunca azot istasyonuna bağlı küçük boru kullanarak çözünmüş oksijen kaldırmak için orta içine. Her şişenin üstüne bir butil kauçuk durdurucu yerleştirin, fazla gaz şişe çıkmak için izin vermek için küçük bir açıklık bırakarak.
30 dakika sonra, crimp mühür her şişe hazırlanan stoper ve alüminyum mühür ile. Alüminyum conta, protokolün geri kalanında şişenin mühürlü kalmasını sağlar. İğneleri ve ince boruları azot istasyonundan koparın ve temiz iğnelerle değiştirin.
Azot tankının vanalarını hassas ve sürekli bir gaz akışının depodan çıkması için ayarlayın. Şimdi, azot tankına bağlı iğnelerden birini kauçuk durdurucu aracılığıyla bir şişe orta içine yerleştirin. Hemen aynı şişeiçine başka bir temiz iğne takın.
Diğer şişeler için bu adımı tekrarlayın ve azot ile şişelerde hava yerine yaklaşık 30 dakika azot akışı sağlar. 30 dakika sonra, ilgili iğne kaldırarak azot istasyonundan bir şişe kopdur. Orta şişedeki basınç atmosfer basıncına azalana kadar birkaç saniye bekleyin ve ikinci iğneyi çıkarın.
Kalan tüm şişeler için bu adımı tekrarlayın. MSR-1 için 120 mililitre yarı katı büyüme ortamı hazırlamak için, kabı alüminyum folyo ile kaplayın ve metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan çözeltiyi otoklav. Otoklav döngüsünün bitiminden hemen önce, yeni bir %4 sistein çözeltisi hazırlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi beş molar sodyum hidroksit çözeltisi ile pH'ı 7.0'a ayarlayın.
Otoklavlama sonra, orta 50 ila 60 santigrat derece soğumasını bekleyin ve bir Bunsen brülör alev altında beher getirmek. Alüminyum folyo çıkarın ve hızlı bir şekilde hafifçe karıştırarak steril teknikler kullanarak metin protokolü listelenen kimyasallar ekleyin. Filtre sterilize sistein çözeltisi 1,2 mililitre ekleyin.
Tüm kimyasalların eklenmesinden sonra, 16 mililitre steril vida kapağı Hungate tüpleri içine sıcak orta aktarın. Her tüp içine orta 12 mililitre aktarın ve tüpleri mühürleyin. MSR-1, AMB-1 ve MS-1'i sıvı ortamda aşılamak için, stoperlere etanol uygulayarak ve bir Bunsen brülörünün ateşinden geçirerek oksijen ve taze orta şişelerin üstlerini ateşleyin.
Steril bir şırınga ve bir iğne kullanarak, oksijen şişesinden bir mililitre oksijen ayıklayın ve taze orta şişeye aktarın. Cam şişede yetiştirilen başka bir kültürden gelen inoculum kullanıyorsanız, her iki şişe alev. Sonra taze orta içine eski kültürün bir mililitre aşılamak.
Kültürü 32 derecede kuluçkaya yatırın ve dört ila yedi gün sonra taze ortama aşılayın. OKSIJEN gradyan, yarı katı ortamda MSR-1 aşılamak için, taze ortam tüpü iyi tanımlanmış bir OAI görüntüler doğrulamak, orta yüzeyinin yaklaşık bir ila üç santimetre altında pembe renksiz arayüzü ile somutlaşmış. Inoculum başka bir oksijen konsantrasyonu gradyan yarı katı kültürgeliyorsa, bakterilerin oluşturduğu bant üzerine yerleştirilen steril bir pipet ucu ile kültürün 50 mikrolitre aspire ederek bakteri hasat.
Bu bakterileri oai'de yavaş yavaş taze ortamda aşılamak, arayüzü rahatsız edici kaçınarak. Tüpü kapatın ve bakterilerin 25 santigrat ile 30 santigrat derece arasında büyümesine izin verin. Bakterilerin hem manyetik hem de modal olduğundan emin olmak için mikroskop kapağı na bir damla kültür yerleştirin.
Kapak fişini çevirin ve cam bir kaydırağa dayanarak o halkası üzerine töyüp kurun. Damlanın alt slayta dokunmadığından emin olun. Bir mikroskop altında asılı damla yerleştirin ve damlacık bir kenarına odaklanın.
Mıknatısın güney kutbunu kenarına yakın bir yere yerleştirin ve bakterilerin kenara doğru yüzmesini izleyin. Onları ters yönde yüzmek yapmak için mıknatıs çevirin. Burada gösterilen aşılama öncesi ve bakteri büyüme sonra sıvı medya şişeleri vardır.
İkinci şişedeki bulanıklık bakterilerin büyüdüğünü gösterir. Bu iki kez hızlandırılmış film bir modal ve manyetik manyetotaktik bakteri kültürü için bir asılı damla deney beklenen sonucu gösterir. Bir manyetik alan uygulandığında bakteriler başlangıçta damlacık kenarına doğru yüzdü.
Mıknatısın alan yönü tersine çevrildiğinde, bakteriler manyetik alanın uygulandığı kenardan yüzerek uzaklaşmaktadırlar. Burada gösterilen aşıöncesi ve bakteri büyümesinden sonra yarı katı orta tüplervardır. Beklendiği gibi, oksik-anoksik arabirimde bir bakteri grubu oluşur ve oksijen tüketilir ve arayüz yukarı hareket ettikçe zaman içinde göç eder.
Burada gösterilen bir manyetik spirillum temsili bir elektron mikrografı. Kamçı siyah oklarla gösterilirken, kırmızı oklar manyetozomları gösterir. Bu prosedürü denerken, manyetotaktik bakterilerin hem düzgün büyümek hem de manyetozom üretmek için çok özel oksijen seviyesi gereksinimleri olduğunu hatırlamak çok önemlidir.
Bu protokol, bu organizmalar tarafından tercih edilen mikro koşullara ulaşmak için büyüme ortamındaki oksijen seviyelerinin nasıl kontrol edilip izlendiğini göstermektedir. Bu yöntemden sonra yüksek konsantrasyonlarda sağlıklı ve yüksek manyetik hücreler elde edilebilir. Bu şekilde, manyetozom çıkarma, genomik ve genetik çalışmalar veya mikroskopi ile kolektif hareketin gözlemi gibi büyük miktarlarda bakteri gerektiren deneyler yapılabilir.
Laboratuvarda manyetotaktik bakterileri yetiştirme olasılığı, bilim adamlarının bu organizmaların büyüleyici biyokimyasal ve fiziksel özelliklerini sistematik bir şekilde keşfetmelerine olanak sağladı.
