Grup IV viral genomların konak protein dizilerinin kısa uzantılarını kodladığını gösterdik. Bu sekanslar viral proteaz dekolte sitelerinde bulunabilir. Konak proteinlerin hedefli imhası için kullanılıyorlar, tipik olarak bağışıklık tepkilerini üreten proteinler.
Proteaz tahlilleri kullanmanın en büyük avantajı, bir hücrenin karmaşıklığını ortadan kaldırmasI ve viral bir proteazın belirli bir diziyi kıdap bırakıp çıkaramayacağını göstermesidir. Zika SSHHPS dizilerini analiz ettiğimizde, proteazın bağışıklık yanıtları üreten proteinlerdeki dizileri kesebileceğini ve bu proteinlerin bazılarının beyin ve göz gelişiminde de rol aldığını gördük. Bu tekniği ilk kez yaparken, bölünme gözlenmezise, proteaz aktivitesi gibi çeşitli faktörlere bağlı olabileceğini unutmamak gerekir.
Prosedürü gösteren Jaimee Compton, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Protein BLAST açarak başlayın ve makas bağı ve viral poliprotein çevreleyen 20 amino asitler koymak ve yedeksiz olmayan protein dizileri seçin sonra aranacak konak genom yazın. Gerekirse PHI-BLAST'ı seçin ve kare köşeli ayraçların parantez içindeki amino asitlerin yedek konumda olabileceğini gösterdiği bir desen sırasını yazın ve blast tuşuna basın.
Blast'ın, bir dekolte alanı dizisiyle eşleşen ardışık özdeş veya tolere edilen kalıntı sayısına göre isabet sırasını sıralayın. Listeden, proteaz tahlillerinde analiz için altı veya daha fazla özdeş veya benzer kalıntı içeren proteinleri seçin. Siyan floresan proteinini, dekolte dizisinin 25 amino asitini ve sarı floresan proteinini kodlayan bir plazmid inşa edin.
Daha sonra, cfp ve YFP yüzeyleri bir gecede kültür 25 mililitre ile dört litre lik şişe aşılayarak hazırlayın. Kültürleri 37 santigrat derecede sallayın ve 600 nanometrede UV-Vis spektroskopisi ile büyümeyi saatlik olarak izleyin. Bakteri yaklaşık bir emiciulaştığında, her şişeye bir molar IPTG 0.5 mililitre ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin, sonra sallayarak inkübatörün sıcaklığını 17 dereceye düşürün ve ifadenin bir gecede 17 ila 20 saat devam etmesine izin verin.
Ertesi gün, 4 santigrat derece 10 dakika için 7000 kez g santrifüj ile bakteri pelet. Sıvı ortamı çıkarın ve atın, ardından peletleri eksi 80 derecede saklayın veya hücre lisi ile devam edin. Hücreleri eşitlemek için, el yazması talimatlara göre 100 mililitre lysis tampon hazırlayın, arabellekteki peletleri yeniden askıya alın ve süspansiyonun 25 ila 25 mililitresini 50 mililitrelik tek kullanımlık konik tüplere aktarın.
Tüpleri buzlu suyla plastik bir kabın içine yerleştirin ve sonikucu ucunu tüpün altından yaklaşık bir santimetre olacak şekilde tüpün içine yerleştirin ve sıvı hale gelene kadar 10 ila 20 kez lysate sonicate. Sonication sonra, yüksek hızlı santrifüj tüpler için lysate aktarın ve 4 santigrat derece 30 dakika için 20, 500 x g santrifüj. Supernatant temiz bir şişe ye aktarın ve pelet atın.
Nikel sütununa lysate yükleyin sonra tampon A iki sütun hacimleri ile sütun yıkamak 280 nanometre de tampon B.Absorbance beş sütun hacimleri kolon dan kirletici olarak yıkama sırasında artacaktır. A280 temel değerlere dönene kadar yıkamaya devam edin. Daha sonra proteini %100 tampon B'nin iki ila üç sütun hacmiyle eforuzlayın ve her fraksiyonun A280'ini ölçtüğünden emin olarak 10 mililitre fraksiyon toplayın.
El yazması yönlere ve pipete göre her karışımın 45 mikrolitresi, siyah yarım alanlı 96 kuyuluk bir plakanın her bir sırasının ilk üç kuyusu içine sekiz reaksiyon karışımı hazırlayın. Sabit fotoçarpan tüp ayarı ile iki dalga boyunda floresans eşzamanlı algılama için plaka okuyucu ayarlayın. Okuma süresini dakikada bir okuma ile 20 ila 30 dakikaya kadar programlayın ve okunacak kuyuları seçin.
Plakayı makineye takın ve zaman içinde emisyon oranlarını izleyerek okumaya başlayın. Kesilmemiş alt katmanı içeren plakanın bitiş noktası okumasını çalıştırın. Her kuyuya plaka ve pipet beş mikrolitre enzim çıkarın.
Bir kesilmemiş denetim olarak ilk sütun kaydedebilirsiniz. Daha sonra plakayı 20-30 dakika boyunca tekrar okuyun ve plaka okuyucuyu mutlak değerlere göre ayarladık. Okuma tamamlandıktan sonra, buharlaşmayı önlemek için plakayı filmle kapatın ve enzimin substratı tamamen kesmesini sağlamak için oda sıcaklığında bir gece bekletin.
24 saat sonra, filmi çıkarın ve plakayı bir bitiş noktası okuma gerçekleştirin. Emisyon oranlarını ortalamave kesilmiş olarak kaydedin. SDS-PAGE kullanarak substrat bölünmesini doğrulayın.
Moleküler ağırlık işaretleyicisini ilk veya son şeride yükleyin ve her reaksiyon karışımından beş mikrolitreyi jelin bir şeridine yükleyin, kesilmemiş reaksiyondan başlayarak. Jel tankının elektrotlarını güç kaynağına takın ve ürünleri 110 voltta 60 dakika çalıştırın. Bir çatlama aleti kullanarak jeli kasetten çıkarın ve 5 ila 10 mililitre boyama çözeltisine batırın.
1 ila 24 saat sonra, fazla lekeyi çıkarın ve jeli suya batırın. Sonra jel görüntüleyici kullanarak jel bir resim çekmek. Protein yapısını hazırlamak için, protein PDB dosyasını MOE'ye yükleyin.
Seç ve Çözücü'yi tıklatın ve ardından çözücüyciyi silin. İşlem üst menü çubuğundan Yapı pPreparation panelini açın ve Düzelt'e tıklayarak tüm yapısal öğeleri otomatik olarak düzeltin. Protonate 3D'ye tıklayarak yapıyı protonate edin.
Kısmi Yükler panelini açarak ve AMBER 99'u seçerek proteine kısmi yükler ekleyin ve Hidrojen ve Yalnız Çiftleri Gerektiği gibi ayarlayın. Ardından yapı dosyasını kaydedin. Substrat peptidleri ve TRIM14 için yapı oluşturmak için Protein Oluşturucu panelini açın, alt katman sırasını girin ve Otomatik Yeniden Paket'i seçin.
Ardından, Geometri'yi Genişletilmiş olarak ayarlayın ve Oluştur'a tıklayın. Son olarak yapıyı en aza indirin ve pdb dosyası olarak kaydedin. PyRx AudoDock 4.2 yazılımını kullanarak substrat peptidlerini VEEV-nsP2'ye sabitleyin.
Proteini yükleyin, adı sağ tıklatın ve PDBQT yerleştirme dosyasını hazırlamak için Makromolekül'ü yapın'ı seçin. Sonra substrat molekülü yükleyin ve ligand yerleştirme dosyasını hazırlamak için Ligand olun'u seçin. AutoDock sihirbazını en alttaki yerleştirme panelinden başlatın ve hazırlanan ligand ve protein dosyalarını seçin.
Izgara boyutunu manuel olarak ayarlayarak protein bağlayıcı cebini tanımlayın, ardından AuotGrid'i çalıştırın. Ardından, AutoDock'u çalıştırın ve Lamarckian genetik algoritma yöntemini seçin. Yerleştirme Parametrelerini tıklatın ve GA çalışır sayısını 50'ye ayarlayın ve ardından yerleştirme çalışmasını başlatmak için İleri'yi tıklatın.
AutoDock tamamlandığında, Sonuçları Analiz Et panelini açın ve tahmin edilen tüm bağlama pozlarını inceleyin. Cis-477 ve dekolte yerindeki substrat arasındaki en düşük tahmin edilen bağlama enerjisine ve makul bağlama etkileşimlerine sahip en iyi modeli seçin ve ardından daha fazla MD simülasyonu için PDB dosyası olarak kaydedin. AutoDock ile bağlayıcı pozlar okuduktan sonra, MD simülasyonları ile arıtma için makul bağlama modelini belirlemek için yerleştirme sonrası analizi gerçekleştirmek önemlidir.
Bu protokol, Zika virüsü ns2B/3 proteazında homolog konak-patojen protein dizilerinin veya SSHHPS'nin kısa uzantılarını bulmak için kullanılmıştır. Dört konak protein hedefi belirlendi. FOXGS, SFRP1, retinal cDNA kütüphanesinden bir Gsalpha alt ünitesi, ve NT5M mitokondriyal 5'3'nükleotidaz.
SSHHPS'nin dizi hizalamaları, bölünme alanı dizilerinde türe özgü farklılıklara izin verdi. Zika virüsü tavuk embriyolarında mortalite ve mikrosefali neden olabilir, çünkü SFRP1 dizisi insanlar ve tavuklarda aynıydı. Sürekli test, viral poliprotein dizileri için sabit durum kinetik parametrelerini ve inhibisyon sabitlerini ölçmek için kullanıldı ve belirli bir dizinin bölünmesi veya proteazın çeşitli bileşikler tarafından inhibisyonu gibi nitel bölünme bilgilerini elde etmek için sürekli test edildi.
Venezüella at ensefaliti nsP1-nsP2 kavşak modeli silico yöntemleri kullanılarak yapılmıştır. nsP2 proteaz için, substrat dizisini uzatmak ve tamponun iyonik gücünü azaltmak, Semliki Ormanı virüs dizisinin Michaelis sabitinde önemli bir azalmaya yol açtı. Bu yordamı denerken, denetimleri çalıştırmak önemlidir.
SSHHPS dizi analizine geçmeden önce viral proteaz bölünme sitsıralarını içeren substratlar test edilmelidir. Bir konak proteinin bölünmesi gözlenirse, konak proteinin viral replikasyonu etkilediğini doğrulamak için takip deneyleri yapılmalıdır. Bu aşırı ifade veya protein susturma ve daha sonra viral çoğaltma üzerindeki etkileri inceleyerek yapılabilir.
Grup IV çok sayıda yeni ve yeni ortaya çıkan patojen içerir. SSHHPS dizileri spesifik konak proteinlerini ve yollarını viral proteazlarla çok öngörülebilir bir şekilde birbirine bağlar.
