Bu protokol, mikrovasküler endotel hücrelerini iskelet kaslarından izole etmek için bir platform tekniğini tanımlar. Bu hücreler, örneğin, kan kas bariyerfonksiyonları hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, yüksek saflıkta primer mikrovasküler endotel hücrelerini izole etmek mümkündür.
Bu teknik, sağlık ve hastalık kas ve endotel hücreleri arasındaki etkileşim gibi bağışıklık aracılı kas hastalıkları alanında anahtar soruları cevaplamak için yardımcı olabilir. İlk olarak, protokolde açıklandığı gibi gerekli tüm çözümleri ve altı kuyulu plakaları hazırlayın. Pratik prosedüre başlamak için, bir çift cerrahi keskin/künt makas, bir çift cerrahi keskin/keskin makas ve düz ve kavisli forceps alın.
Tüm cerrahi aletleri %70 etanol ile dezenfekte edin. Ötenaziyapılan yetişkin bir erkek fareyi sırtına yerleştirin ve bacakları %70 etanol ile nemlendirin. Keskin/ künt cerrahi makas kullanarak, kalça eklemini keserek her bacağın tamamını koparın.
Ekstremiteleri kapalı hücre kültürü yemeğine yerleştirin. Yemeği steril bir laminar akış başlığına aktarın. Ayak ucuna kalçadan açık deri kesmek için keskin makas ve kavisli forceps kullanın.
Ayak veya ayak yastığı nı tutmak için düz forceps'u kullanın, kavisli forceps'u kullanarak deriyi ayak altından kalçaya doğru sök. Musculus quadriceps femoris izole etmek için, diz tendon kesmek, ve kalça uyluk boyunca kas kesmek. Musculus triceps surae izole etmek için Aşil tendonu ayırın.
Sonra, popliteal fossa tibia boyunca kesilmiş ve kas kaldırmak. Ayrıştırılamayan tendonu çıkarmak için, kavisli forceps ile kasları tutun ve her uygun tendonu kesti. Taze, etiketli hücre kültürü yemeğine hazırlanmış sindirim çözeltisinin 2, 445 mikrolitresini ekleyin ve ağırlığı belirleyin.
Tüm kas parçalarını bu tabağa aktarın. Sonra, ağırlığı belirleyin. Ölçülen her iki değerin farkı, kas dokusunun bir gramı geçmemesi gereken kuru ağırlığını sağlar.
Cerrahi keskin makas kullanarak, küçük parçalar halinde tüm kas dokusu kesti. Doku süspansiyonuna 37 derecede %5 karbondioksit le 1,5 saat kuluçkaya yatarak süspansiyonu yaklaşık beş dakika boyunca her 20 dakikada bir mililitrelik insülin şırıngasıyla dikkatlice karıştırın. Kuluçkadan sonra süspansiyonu 50 mililitrelik etiketli bir tüpe yerleştirilen 70 mikrometrelik naylon süzgeçe aktarın ve akışı toplayın.
Hücre süzgecini sekiz mililitre DMEM ile yıkayın ve akışı toplayın. Parçalar süzgeçi takıyorsa, ayrık çözeltiyi yeniden askıya alın. Hücre süzgeci atın ve 10 dakika boyunca 300 kat yerçekimi ve 20 derece santigrat süspansiyon santrifüj.
Dikkatle supernatant kaldırmak ve kırmızı kan hücrelerinin lysis için bir amonyum klorür potasyum lysing tampon bir mililitre hücre pelet resuspend. 30 saniye boyunca oda sıcaklığında kuluçka. Daha sonra, reaksiyonu durdurmak için %10 FCS içeren dokuz mililitre DMEM ekleyin.
Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp aktarın. Daha sonra, hücre numaralarını belirlemek için bir Neubauer hücre sayma odası kullanın. CD45-pozitif hücreleri tükenmeye başlamak için süspansiyonu 300 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.
Supernatant'ı tamamen çıkarın ve 90 mikrolitre MCS tamponundaki hücre peletini yeniden askıya alın. 10 mikrolitre CD45 mikroboncuk ekleyin ve süspansiyonu karıştırın. 15 dakika boyunca 4-8 santigrat derecede bir buzdolabında kuluçka.
Bundan sonra, bir mililitre MCS arabelleği ekleyin. 300 kat yerçekiminde santrifüj ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede. Süpernatant'ı tamamen çıkarın ve 500 mikrolitre MCS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın.
Ayırıcının manyetik alanına büyük bir manyetik kolon yerleştirin. Üç mililitre MCS tamponuyla sütunun rezervuarını durulayın. Daha sonra, içinden akışı toplamak için sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin.
Tüm hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve tamamen akmasına izin verin. Her yıkama adımı için rezervuara üç mililitre MCS tampon u ekleyerek ve bir sonraki yıkama adımına başlamadan önce sütunun rezervuarının boşalmasını bekleyerek sütunu üç kez yıkayın. Daha fazla ayırma adımlarında kullanılmak üzere sütundan geçen etiketlenmemiş hücreleri toplayın.
CD31-pozitif hücreleri toplamaya başlamak için, hücre numaralarını belirlemek için bir Neubauer hücre sayma odası kullanın. Daha sonra, etiketlenmemiş hücreleri 300 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı tamamen çıkarın ve 90 mikrolitre MCS tamponundaki peleti yeniden askıya alın.
10 mikrolitre CD31 mikroboncuk ekleyin ve tüm süspansiyonu karıştırın. 15 dakika boyunca 4-8 santigrat derecede bir buzdolabında kuluçka. Bundan sonra, 300 kez yerçekimi ve 10 dakika boyunca dört derece santigrat bir mililitre MCS tampon ve santrifüj ekleyin.
Supernatant çıkarın ve MCS tampon 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Orta manyetik kolonu ayırıcının manyetik alanına yerleştirin. 500 mikrolitre MCS tamponuyla sütunu durulayın.
Daha sonra, akışı toplamak için sütunun altına 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin. Tüm hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve tamamen akmasına izin verin. Her yıkama adımı için rezervuara 500 mikrolitre MCS tamponu ekleyerek sütunu üç kez yıkayın ve bir sonraki yıkama adımına başlamadan önce sütunun rezervuarının boşalmasını bekleyin.
Sütunu geçen etiketlenmemiş hücreler CD45-negatif, CD31-negatif fraksiyonu temsil eder. Daha fazla kalite kontrolleri için saklayın. Ardından, kolon ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin.
Pipet iki mililitre MCS tamponu sütunun üzerine. Hemen manyetik etiketli hücreleri floş için sütuniçine piston itin. Bu CD45-negatif, CD31-pozitif fraksiyonu zenginleştirilmiş birincil murine ECs temsil eder.
Hücre süspansiyonuna 350 kat yerçekimi ve 20 derecede 5 dakika santrifüj edin. Supernatant tamamen çıkarın ve endotel hücreli orta bir mililitre hücreleri resuspend. Hücreleri, bir mililitre endotel hücreli ortam içeren altı kuyulu bir kültür plakasının tek bir kuyuya aktarın.
Ekim için, steril bir kuluçka makinesinde% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece hücreleri kuluçka, her iki ila üç günde bir orta yenilemek için emin olun. Hücreler %80 ila %90 oranında birleştiğinde, her iyi içeren hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez ardışık yıkama adımlarında durulayın. Daha sonra, her kuyuya 800 mikrolitre tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve steril bir kuluçka makinesinde %5 karbondioksitle 37 derecede 37 santigrat derecede üç ila beş dakika kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, enzimatik aktiviteyi durdurmak için en az %10 FCS içeren 1, 200 mikrolitre DMEM ekleyin. Santrifüj 350 kat yerçekimi ve 20 santigrat derecede beş dakika. Daha sonra, daha önce saflığı artırmak için açıklandığı gibi CD31 hücreleri birikir.
Hücre birleşimini gözlemlemek için %20 büyütme ve 0,35 lens sayısal diyafram açıklığına sahip parlak bir alan veya standart faz sözleşme mikroskobu kullanın. Bu çalışmada primer murine iskelet kası mikrovasküler endotel hücreleri izole edilmiştir. Bir gün izolasyondan sonra, birincil murine MMECs ve artık diğer hücreler konglomeralar oluşturmak ve kültür yemekleri altına yapışır.
Yedinci günden itibaren, düz ve uzamış hücreler görülebilir, ancak, diğer kontaminasyon, çoğunlukla küresel hücrelerin hala görülebilir. Böylece, MCS ile CD31-pozitif seçim başka bir döngü gereklidir. Bundan sonra, birincil murine MMECs yaklaşık bir yoğunluk tayılmak 80-90%Birleştirme üzerine, genellikle uzunlamasına hizalanmış hücrelerin örtüşen olmayan bir monolayer oluşturur.
Kontak tetkiki nedeniyle çoğalma durur. Akış sitometrisi ile kalite kontrol, izolasyondan hemen sonra hücreler için her biri %70 civarında değişen canlılık ve saflık değerleri gösterir. MCS aracılığıyla başka bir CD31-pozitif seçimden sonra yetiştirilen hücreler, her biri %95'e kadar değişen saflık ve canlılık için tatmin edici değerler gösterir.
Elde edilen hücreler daha sonra kantitatif PCR ile mRNA düzeyinde kutu protein 7 ve M-kadherin eşleştirilmiş kas uydu hücre marker genlerinin gen ekspresyonu için araştırılır. Beklendiği gibi, sadece CD45-negatif, CD31-negatif fraksiyonu yanı sıra farklılaşmış primer mindik kas hücreleri kutu protein 7 ve M-kadherin ifade, CD45-negatif ise, CD31-pozitif ve primer murine MMECs bu belirteçleri için negatif. İkinci CD31 MCS adımından sonra, qPCR konfluent primer murine mmecs sıkı kavşak proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılır.
Primer murine MMECs claudin-5, oklüdin ve zonula oklüden-1 yüksek düzeyde ifade görülür, pmMC sadece zonula oklüdens-1 düşük bir ifade gösterirken. Bu teknik 5-6 saat içinde yapılabilir. Bu protokolü takiben, ek soruları yanıtlamak için geçiş denemeleri veya düşük kesme gerilimi deneyleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, mekanik ve enzimatik dissosilasyon ve manyetik hücre sıralama ile iskelet kaslarından birincil mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek gerekir.
