Bu protokol, S.aureus biyofilm kültüründe alkalize fosfataz aktivitesini ölçmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sunmuştur. ALP'in biyofilm oluşumundaki işlevini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek iş bölümüdür.
Çok hassas ve gerçekleştirmek kolaydır. Prosedürü gösteren Kevin Danikowski, Harper Koleji'nden eski bir öğrenci olacaktır. TSB hazırlamak için, kazein pankreas sindirimi ekleyin, soya küskülünün papaik özeti, sodyum klorür, dekstroz, ve dipotasyum fosfat distile suya.
Alüminyum folyo ile şişe kapağı ve kullanmadan önce sterilize etmek için bir otoklav koymak. Bir TSA hazırlamak için, TSB agar ekleyin ve sterilizasyon için otoklav koymak. Sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
Daha sonra, çanak başına 20 mililitre oranında Petri kabına dökün. Bir biyofilm kültür ortamı hazırlamak için, litre başına 10 gram konsantrasyon elde etmek için otoklavlı TSB glikoz ekleyin. Vakum filtrasyon kiti kullanarak, çözeltiyi 0,2 mikrometre gözenek boyutunda filtre ile dosyalayın.
Aşılamak için, Petri kabından tek bir Staph aureus kolonisini seçmek ve 10 mililitre TSB ile dolu kültür tüpüne yerleştirmek için sterilize edilmiş bir aşılama döngüsü kullanın. Tüpü kuvöze koy up bir gecede 37 santigrat derecede büyüy. Bir mikropipet ile, bir gecede kültür 100 mikrolitre çizmek ve 1:100 hacim oranı seyreltme için glikoz ile TSB 10 mililitre dolu bir kültür tüpü aktarın.
Girdap yavaşça tutarlı bir konsantrasyon için karıştırmak için. Bir 96 kuyu plakasından toplam 18 kuyuya 200 mikrolitre seyreltilmiş kültür aktarmak için bir mikropipet kullanın. Biyofilm oluşumu için 96 kuyu plakasını 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.
S.aureus en iyi biyofilm oluşumu için, düz veya yuvarlak alt 96 iyi plaka almak daha iyidir. Bundan sonra, her kuyunun kenarından aspirasyon ile supernatant decant için biraz plaka tilt. Her bir kuyuya 1X PBS ile yıkayın.
Plakayı dakikada 8,000 devirde beş dakika döndürmek için santrifüje koyun ve aspirasyonla süpernatant'ı dekantlayın. Her kuyuya ticari olarak kullanılabilen PNPP'den oluşan 75 mikrolitre arabelleğe alan ALP substratı ekleyin ve her zaman noktasını triplicate olarak kaydetmek için bir zamanlayıcı kullanın. Her kuluçka zaman noktasından sonra, reaksiyonu durdurmak için üç kuyunun her birine beş molar sodyum hidroksit75 mikrolitre ekleyin.
Dakikada 800 devirde tabağı beş dakika santrifüj edin. Kalorimetrik ölçüm için 100 mikrolitre supernatant'ı yeni bir 96 kuyu plakasına aktarmak için bir pipet kullanın. 405 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir 96 iyi plaka okuyucu kullanın.
Arka plan gürültüsünü kontrol etmek için 30 dakikalık zaman noktası kuyularını kullanın. Tüm deneyi üç 96 kuyu plakası halinde tekrarlayın. Bu protokol, protein izolasyonu gerektirmeyen S.aureus biyofilmdeki ALP aktivitesini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir test geliştirir.
ALP aktivitesinin temsili sonucu 75 dakikaya kadar artış eğilimi gösterir. 75 dakika sonra ALP aktivitesinde bir artış gözlenmedi. İyi bir biyofilm kültürü oluşturmak çok önemlidir ve ustalaşmak için birkaç deneme gerekebilir.
Daha önce bizim ve başkaları tarafından bildirilen kristal mor teşleyi yaparak biyofilm oluşumunu onaylayabilir ya da biyofilm oluşumunu kolaylaştırmak için plakayı insan plazması ile tedavi edebilirsiniz. Geliştirildikten sonra, biyofilm oluşumunu engelleyebilecek potansiyel ALP inhibitörlerini tarayabilirsiniz. Sonuç, tıp alanında biyofilm yönetimi ne kadar önemli bilgiler sağlayacaktır.
Beş azı lı sodyum hidroksit temas halinde tehlikeli olabilir. Kullanım yaparken kişisel koruyucu ekipman taktığından emin olun.
