Cette technique sert de méthode de base pour les expériences conçues pour apaiser le développement embryonnaire ou larvaire du cricket. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est flexible et qu’elle soutiendra plusieurs types d’approches expérimentales, telles que celles utilisant l’interférence arn ou la manipulation génomique. Hadley Wilson Horch, chercheuse principale au laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer cette procédure humide le plan de broyeur de filature du biseau avec de l’eau qui coule. Placez l’aiguille tirée dans le biseau et tournez-la à un angle de 20 degrés. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche simplement la plaque de broyage et biseauté pendant deux à trois minutes.
Évaluez le biseau en plaçant l’aiguille biseauté sur du ruban adhésif double qui a été adhéré à une lame de microscope en verre. Placez la diapositive sur la scène d’un microscope composé équipé d’un logiciel d’acquisition d’appareils photo et d’images. Acquérir une image de l’aiguille à l’aide d’un objectif 20x.
Utilisez le logiciel d’imagerie pour mesurer le diamètre intérieur lumen de l’aiguille juste proximale à l’ouverture biseauté. Jetez les aiguilles dont l’ouverture est inférieure à huit micromètres ou supérieure à 12 micromètres. Tout d’abord, faire 40 millilitres de 1% agarose dans l’eau et le verser dans une boîte de 10 centimètres Petri.
Placer un timbre de puits d’œuf à la surface de l’agarose avant qu’il ne se solidifie. Une fois l’agarose solidifiée, retirez le timbre pour révéler les puits. Ensuite, remplissez la plaque de puits agarose avec HBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline.
Placez le couvercle sur le plat, enveloppez-le dans parafilm et rangez-le à quatre degrés Celsius. Après cela, remplissez une boîte de Petri de 35 millimètres de sable blanc de terrain de jeux pour faire un plat de collecte d’oeufs pour les grillons à pondre des œufs po Couvrir le plat d’oeufs d’un carré de serviette en papier coupé à environ 18 par 18 centimètres.
Remplir d’eau du robinet à travers la serviette en papier. Ensuite, inclinez la boîte de Pétri et pressez doucement le dessus pour enlever l’excès d’eau. Rentrez les coins du carré de serviette en papier sous le plat et placez le plat d’oeufs dans un couvercle inversé qui aidera à maintenir la serviette en papier en place.
Placer le plat d’oeufs dans le bac de cricket et laisser les femelles adultes oviposit les œufs pendant une à deux heures. Pendant ce temps, laisser chauffer le plat d’agarose à température ambiante en vue de la tenue des œufs pour injection. Une fois prêt, retirer le plat de collecte des œufs, qui contient maintenant des œufs fraîchement pondus, du bac de cricket.
Retirer l’essuie-tout et placer une passoire avec une taille de pore comprise entre 0,5 et un millimètre sur un bécher. Rincer le contenu du plat de ponte dans la passoire sous l’eau du robinet qui fonctionne doucement. Les grains de sable tomberont à travers la maille de la passoire dans le bécher ci-dessous tandis que les oeufs de cricket resteront dans le panier de passoire.
Remplissez un récipient d’eau d’osmose inverse et placez-le dans un plateau. Inverser la passoire sur le récipient et la tapoter contre le plat pour déloger les œufs dans l’eau. Les œufs couleront au fond du récipient.
Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la pointe d’une pointe de pipette P1000 pour faire une ouverture d’environ trois millimètres de diamètre. Placez cette pointe sur un pipetter P1000, et utilisez-le pour transférer les oeufs du récipient au plat de moules à oeufs agarose. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, aligner les œufs dans les puits agarose.
Chaque œuf coulera au fond d’un puits individuel. Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle jusqu’à ce qu’elle soit prête à s’injecter. Pour commencer, placez le plat d’œufs sous le microscope disséquant et sélectionnez un faible grossissement d’environ 10x.
Dessinez 1,5 microlitres de solution d’injection à l’aide de 20 conseils de chargement de microlitres et d’une pipette P10 et insérez la pointe de chargement dans l’extrémité large de l’aiguille d’injection. Expulser la solution d’injection dans l’aiguille d’injection. Insérez l’aiguille dans le boîtier d’injection et serrez-la, en vous assurant que l’aiguille est correctement et fermement insérée dans le boîtier.
Insérez ensuite soigneusement le boîtier d’injection dans le micromanipulateur, en prenant soin de ne pas casser ou d’être blessé par l’aiguille. Tout en regardant les oeufs et l’aiguille à travers le microscope, déplacez l’aiguille près du X dans le coin supérieur gauche de la grille de vaisselle. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que la pointe entre dans le HBS plus la solution tamponnée de streptomycine de pénicilline dans le plat.
Centrer l’aiguille dans le champ de vision et déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est de quelques millimètres plus près du bord du plat que les œufs. Après cela, réglez le microscope sur le filtre approprié pour rhodamine pour observer la fluorescence dans l’aiguille et se concentrer sur sa pointe. Sur le microinjecteur tourner lentement le bouton d’équilibre dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la solution d’injection commence à s’échapper de l’aiguille dans la solution de suspension.
Puis tournez le bouton en arrière dans le sens inverse des aiguilles d’une montre légèrement jusqu’à ce que le colorant cesse juste de fuir de l’aiguille. Avec l’aiguille toujours centrée dans le champ de vision, déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est dirigée vers l’œuf à injecter en premier. Ajustez le grossissement à environ 50x de sorte qu’un seul œuf remplit la majeure partie du champ de vision.
Utilisez à la fois le micromanipulateur et la main sur le plat d’oeufs pour déplacer l’aiguille en position pour l’injection. Utilisez le micromanipulateur pour faire avancer l’aiguille et insérer la pointe dans le premier œuf à être injecté, en vous assurant d’insérer l’aiguille à 20 à 30% de la longueur de l’œuf de l’extrémité postérieure de l’œuf perpendiculairement au long axe de l’œuf. Injectez la solution avec la pédale d’injection ou le bouton d’injection sur le microinjecteur.
Un petit bolus de matériel fluorescent à l’intérieur de l’œuf indiquera une injection réussie. Après cela, retirer l’aiguille de l’œuf. Si l’œuf est soulevé involontairement hors de son puits après la rétractation de l’aiguille, utilisez de petits forceps pour pousser l’œuf dans le puits tout en rétractant l’aiguille.
Dans cette étude, les œufs de cricket sont injectés à l’aide d’une technique qui sert de méthode de base dans de nombreuses expériences, y compris, sans s’y limiter, l’interférence arn et la manipulation génomique. Le taux de survie est un paramètre important pour évaluer le succès de cette expérience. La plupart des œufs morts peuvent facilement être identifiés par la vue que le jaune et le tissu embryonnaire dans l’œuf commencent à s’agglutiner inégalement, et finalement la plupart du jaune migrera vers un côté de l’œuf.
Lorsqu’ils ont été évalués après quatre à six jours, plus de 85 % des œufs non injectés ont survécu, tandis que les œufs injectés avec des réaignants expérimentaux avaient généralement un taux de survie inférieur. Le contrôle de tous les aspects de l’injection elle-même, y compris la ponction de l’aiguille, l’introduction de colorant et de tampon, ou la présence d’ARN de véhicule ou de double brin, est nécessaire afin de comprendre les véritables effets de la manipulation expérimentale tentée. La façon dont on évalue les résultats phénotypiques de l’injection dépend de ce qui a été injecté.
Par exemple, les changements phénotypiques à la suite de renversements spécifiques de l’ARNm peuvent être évidents au niveau de l’anatomie brute. Si, d’autre part, un cDNA codant un gène EGFP marqué histone 2B sous le contrôle d’un promoteur d’actine G.bimaculatus est inséré dans le génome du cricket à l’aide de la transposase de ferroutage, il devient possible de visualiser chaque noyau de l’œuf à l’aide de fluorescence pour exciter la protéine hist 2B taguée EGFP. Ajuster l’équilibre de sorte que les aiguilles ne obstruent pas est une étape critique dans cette procédure.
Vous devrez peut-être faire plusieurs ajustements après les injections subséquentes puisque le jaune obstrue parfois la pointe de l’aiguille. Le cricket est un insecte hémimétabolique qui se ramifie basiquement à des insectes holométaboliques bien étudiés tels que Drosophila. L’étude du développement du cricket nous aidera à mieux comprendre l’évolution et le développement à travers le règne animal.
Cette technique demande un peu de pratique. Nous recommandons de pratiquer des injections de contrôle jusqu’à ce que le taux de survie quatre ou cinq jours après l’injection soit d’au moins 80%
