Этот метод служит основополагающим методом для экспериментов, направленных на анализ эмбрионального или личиночкового развития крикета. Основным преимуществом этого метода является то, что он является гибким и будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, таких как использование РНК-интерференции или геномных манипуляций. Демонстрацией процедуры будет Хэдли Уилсон Хорч, главный исследователь в лаборатории.
Для начала этой процедуры промокнет вращающаяся плоскость мясорубки с капающей водой. Поместите вытянутую иглу в скошен и поверните ее под углом 20 градусов. Опустите иглу, пока она просто касается шлифовальной пластины и скошенной его в течение двух-трех минут.
Оцените скошенную, поместив скошенную иглу на двойную палку, которая была прилипла к слайду стеклянного микроскопа. Поместите слайд на сцену составного микроскопа, оснащенного камерой и программным обеспечением для получения изображений. Приобрети изображение иглы с помощью 20-х целей.
Используйте программное обеспечение для визуализации для измерения диаметра внутреннего люмена иглы просто проксимальной к скошенному отверстию. Откажитесь от любых игл с отверстием менее восьми микрометров или более 12 микрометров. Во-первых, сделать 40 миллилитров 1%agarose в воде и залить его в 10 сантиметров чашки Петри.
Поместите яйцо хорошо штамп на поверхности агарозы, прежде чем она затвердевает. Как только агароза затвердеет, снимите штамп, чтобы выявить скважины. Далее, заполнить агарозу хорошо пластины с HBS содержащие 1%пенициллин стрептомицин.
Поместите крышку на блюдо, оберните его в Parafilm и хранить его при четырех градусах по Цельсию. После этого заполните 35-миллиметровую чашку Петри белым песком детской площадки, чтобы сделать блюдо для сбора яиц для сверчков, чтобы отложить яйца дюйма Обложка яйцо блюдо с бумажным полотенцем площади сократить примерно до 18 на 18 сантиметров.
Заполните водопроводной водой через бумажное полотенце. Затем наклоните чашку Петри и аккуратно сожмите верхнюю часть, чтобы удалить избыток воды. Tuck углы бумажного полотенца площади под блюдом и поместите яйцо блюдо в перевернутой крышкой, которая поможет сохранить бумажное полотенце на месте.
Поместите яйцо блюдо в крикет бен и позволяют взрослым женщинамoviposit яйца в течение одного-двух часов. Между тем, дайте агарозе блюдо прогреться до комнатной температуры в рамках подготовки к проведению яйца для инъекций. Когда он будет готов, удалите блюдо для сбора яиц, которое теперь содержит свежеотложенные яйца, из ящика для крикета.
Снимите бумажное полотенце и поместите ситечко с размером поры от 0,5 до одного миллиметра над стаканом. Промыть содержимое яйца укладки блюдо в ситечко под мягко проточной водопроводной водой. Песчинки будут падать через ситечко сетки в стакан ниже в то время как крикет яйца остаются в корзине ситечко.
Заполните контейнер с обратной водой осмоса и поместите его в лоток. Переверните ситечко над контейнером и коснитесь его о блюдо, чтобы выбить яйца в воду. Яйца утонут на дно контейнера.
Далее, используйте ножницы, чтобы отрезать кончик наконечника P1000 пипетки, чтобы сделать отверстие примерно три миллиметра в диаметре. Поместите этот совет на P1000 pipetter, и использовать его для передачи яйца из контейнера в агарозы яичные формы блюдо. Используя пластиковые пинцеты, выстраивайте яйца в колодцы агарозы.
Каждое яйцо будет опускаться на дно отдельных хорошо. Накройте чашку Петри крышкой до готовности к инъекциям. Для начала поместите блюдо из яиц под рассечение микроскопа и выберите низкое увеличение около 10x.
Нарисуйте 1,5 микролитров инъекционного раствора с помощью 20 микролитров для загрузки и пипетки P10 и вставьте наконечник загрузки в широкий конец иглы для впрыска. Изгнать инъекционный раствор в инъекцию иглы. Вставьте иглу в инъекционный корпус и затяните, убедившись, что игла правильно и прочно вставлена в корпус.
Затем аккуратно вставьте инъекционный корпус в микроманипулятор, будьте осторожны, чтобы не сломаться или получить травму иглы. Глядя на яйца и иглу через микроскоп, переместить иглу возле X в верхнем левом углу сетки блюдо. Нижняя игла, пока кончик входит в HBS плюс пенициллин стрептомицин буферного раствора в блюде.
Центр иглы в поле зрения и переместить яйцо блюдо так, что игла на несколько миллиметров ближе к краю блюда, чем яйца. После этого установите микроскоп на фильтр, подходящий для родамина, чтобы наблюдать флуоресценцию в игле и сосредоточиться на ее кончике. На микроинъекторе медленно поверните ручку баланса по часовой стрелке до тех пор, пока раствор инъекции не начнет просачиваться из иглы в раствор подвески.
Затем поверните ручку назад против часовой стрелки немного, пока краситель просто перестает просачиваться из иглы. С иглой все еще центрируется в поле зрения, переместить яйцо блюдо так, что игла направлена на яйцо, которое будет введено в первую очередь. Отрегулируйте увеличение примерно до 50 раз, чтобы одно яйцо заполнял большую часть поля зрения.
Используйте как микроманипулятор, так и руку на яичном блюде, чтобы переместить иглу в положение для инъекции. Используйте микроманипулятор для продвижения иглы и вставить кончик в первое яйцо, которое будет введено, убедившись, что вставить иглу на 20 до 30% от длины яйца от задней части яйца перпендикулярно длинной оси яйца. Ввимите раствор либо педалью ноги впрыска, либо кнопкой впрыска на микроинжекторе.
Небольшой болюс флуоресцентного материала внутри яйца будет означать успешную инъекцию. После этого, втягивать иглу из яйца. Если яйцо непреднамеренно подняли из его хорошо на опровержение иглы, использовать небольшие миппы, чтобы подтолкнуть яйцо обратно в колодец при втягивания иглы.
В этом исследовании, крикет яйца вводят с использованием техники, которая служит основополагающим методом во многих экспериментах, в том числе, но не ограничиваясь, РНК-интерференции и геномных манипуляций. Выживаемость является одним из важных параметров для оценки успеха этого эксперимента. Большинство мертвых яиц можно легко определить на виду, как желток и эмбриональной ткани в яйце начинают слипаться неравномерно, и в конечном итоге большая часть желтка будет мигрировать в одну сторону яйца.
При оценке через четыре-шесть дней, более 85% нецелеприимных яйцеклеток выжили, в то время как яйца, введенные с экспериментальными реагентами, как правило, имели более низкую выживаемость. Контроль за всеми аспектами самой инъекции, включая прокол иглы, введение красителя и буфера, или наличие транспортного средства или двойной мель РНК, требуется для того, чтобы понять истинные последствия экспериментальной попытки манипуляции. Способ оценки фенотипических результатов инъекций зависит от того, что было введено.
Например, фенотипические изменения в результате конкретных нокдаунов мРНК могут быть очевидны на уровне валовой анатомии. Если с другой стороны, cDNA кодирования EGFP помечены гистона 2B гена под контролем G.bimaculatus actin промоутер вставляется в геном крикета с помощью контрейлерных транспозазы, становится возможным визуализировать каждое ядро в яйце с помощью флуоресценции, чтобы возбудить EGFP помечены ГИСТ 2B белка. Корректировка баланса таким образом, чтобы иглы не засоряли является важным шагом в этой процедуре.
Возможно, вам придется внести несколько корректировок после последующих инъекций, так как желток иногда забивает кончик иглы. Сверчок hemimetabolous насекомое которое ветвит базально к наилучшим образом изученным holometabolous насекомым such as Drosophila. Изучение развития крикета поможет нам лучше понять эволюцию и развитие в животном мире.
Этот метод требует некоторой практики. Мы рекомендуем практиковать контрольные инъекции до тех пор, пока выживаемость через четыре-пять дней после инъекции не будет не менее 80%
