Esta técnica serve como um método fundamental para experimentos projetados para avaliar o desenvolvimento embrionário ou larval do críquete. A principal vantagem dessa técnica é que ela é flexível e suportará vários tipos de abordagens experimentais, como aquelas que utilizam interferência de RNA ou manipulação genômica. Demonstrando o procedimento estará Hadley Wilson Horch, o principal investigador do laboratório.
Para começar este procedimento molhe o plano de moedor giratório do beveler com água pingando. Coloque a agulha puxada no beveler e gire-a para um ângulo de 20 graus. Abaixe a agulha até que ela toque apenas a placa de moagem e coloque-a por dois a três minutos.
Avalie o bisel colocando a agulha chanfrada na fita de vara dupla que foi aderida a um slide de microscópio de vidro. Coloque o slide no palco de um microscópio composto equipado com um software de aquisição de câmera e imagem. Adquira uma imagem da agulha usando um objetivo de 20x.
Use o software de imagem para medir o diâmetro do lúmen interior da agulha apenas proximal à abertura chanfrada. Descarte quaisquer agulhas com uma abertura menor que oito micrômetros ou maior que 12 micrômetros. Primeiro, faça 40 mililitros de 1% de água e despeje-o em uma placa de Petri de 10 centímetros.
Coloque um carimbo de ovo na superfície da agarose antes de solidificar. Uma vez que a ágarose é solidificada, remova o carimbo para revelar os poços. Em seguida, encha a placa de agarose bem com HBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%.
Coloque a tampa sobre o prato, enrole-a em Parafilm e armazene-a a quatro graus Celsius. Depois disso, encha uma placa de Petri de 35 milímetros com areia branca para fazer uma placa de coleta de ovos para os grilos colocarem ovos. Cubra o prato de ovo com um corte quadrado de papel toalha para aproximadamente 18 por 18 centímetros.
Encha com água da torneira através da toalha de papel. Em seguida, incline a placa de Petri e aperte suavemente a parte superior para remover o excesso de água. Coloque os cantos do quadrado de papel toalha sob o prato e coloque o prato de ovo em uma tampa invertida que ajudará a manter a toalha de papel no lugar.
Coloque o prato de ovo na caixa de críquete e deixe que as fêmeas adultas oviposit os ovos por uma a duas horas. Enquanto isso, deixe o prato de agarose aquecer à temperatura ambiente em preparação para segurar os ovos para injeção. Quando estiver pronto, remova o prato de coleta de ovos, agora contendo ovos recém colocados, da caixa de críquete.
Retire a toalha de papel e coloque um coador com um tamanho de poros entre 0,5 e um milímetro sobre um béquer. Enxágüe o conteúdo do prato de colocação do ovo no coador sob água da torneira suavemente corrente. Os grãos de areia cairão através da malha do coador no béquer abaixo enquanto os ovos de críquete permanecem na cesta de coador.
Encha um recipiente com água de osmose reversa e coloque-o em uma bandeja. Inverta o coador sobre o recipiente e bata-o contra o prato para desalojar os ovos na água. Os ovos afundarão no fundo do recipiente.
Em seguida, use uma tesoura para cortar a ponta de uma ponta de pipeta P1000 para fazer uma abertura de aproximadamente três milímetros de diâmetro. Coloque esta dica em uma pipetter P1000, e use-a para transferir os ovos do recipiente para o prato de moldes de ovos de agarose. Usando pinças plásticas, alinhe os ovos nos poços de agarose.
Cada ovo afundará no fundo de um poço individual. Cubra a placa de Petri com uma tampa até estar pronta para injetar. Para começar, coloque o prato de ovos sob o microscópio de dissecação e selecione uma baixa ampliação de cerca de 10x.
Elasenhe 1,5 microliters de solução de injeção usando 20 pontas de carregamento de microliter e uma pipeta P10 e insira a ponta de carregamento na extremidade larga da agulha de injeção. Expulse a solução de injeção para dentro da agulha de injeção. Insira a agulha na caixa de injeção e aperte, certificando-se de que a agulha está bem e firmemente inserida na carcaça.
Em seguida, insira cuidadosamente a carcaça de injeção no micromanipulador, tomando cuidado para não quebrar ou ser ferido pela agulha. Ao olhar para os ovos e agulha através do microscópio, mova a agulha perto do X no canto superior esquerdo da grade do prato. Abaixe a agulha até que a ponta entre na solução tamponada de estreptomicina de penicilina no prato.
Centralizar a agulha no campo da visão e mover o prato de ovo para que a agulha esteja alguns milímetros mais perto da borda do prato do que os ovos. Depois disso, coloque o microscópio no filtro apropriado para Rhodamine observar a fluorescência na agulha e focar em sua ponta. No microinjetor gire lentamente o botão de equilíbrio no sentido horário até que a solução de injeção comece a vazar da agulha para a solução de suspensão.
Em seguida, gire o botão para trás no sentido anti-horário ligeiramente até que o corante pare de vazar para fora da agulha. Com a agulha ainda centrada no campo de visão, mova o prato de ovo para que a agulha seja direcionada para o ovo a ser injetado primeiro. Ajuste a ampliação para cerca de 50x para que um único ovo encha a maior parte do campo de visão.
Use o micromanipulador e a mão no prato do ovo para mover a agulha em posição para a injeção. Use o micromanipulador para avançar a agulha e insira a ponta no primeiro ovo a ser injetado, certificando-se de inserir a agulha em 20 a 30% do comprimento do ovo da extremidade posterior do ovo perpendicular ao eixo longo do ovo. Injete a solução com o pedal do pé de injeção ou o botão de injeção no microinjetor.
Um pequeno bolus de material fluorescente dentro do ovo indicará uma injeção bem sucedida. Depois disso, retraia a agulha do ovo. Se o ovo for involuntariamente retirado de seu poço após a retração da agulha, use pequenas fórceps para empurrar o ovo de volta para o poço enquanto retrai a agulha.
Neste estudo, os ovos de críquete são injetados usando uma técnica que serve como um método fundamental em muitos experimentos, incluindo, mas não se limitando a, interferência de RNA e manipulação genômica. A taxa de sobrevivência é um parâmetro importante para avaliar o sucesso deste experimento. A maioria dos ovos mortos pode ser facilmente identificada pela visão como a gema e o tecido embrionário dentro do ovo começam a se agrupar de forma irregular, e eventualmente a maior parte da gema migrará para um lado do ovo.
Quando avaliados após quatro a seis dias, mais de 85% dos ovos não injetados sobreviveram, enquanto os ovos injetados com reagentes experimentais geralmente tinham uma taxa de sobrevivência menor. O controle de todos os aspectos da injeção em si, incluindo a punção da agulha, a introdução de corante e tampão, ou a presença de RNA de veículo ou duplamente encalhado, é necessário para entender os verdadeiros efeitos da manipulação experimental tentada. A forma como se avalia os resultados fenotípicos da injeção depende do que foi injetado.
Por exemplo, mudanças fenotípicas como resultado de knockdowns específicos de mRNA podem ser óbvias no nível de anatomia bruta. Se, por outro lado, um cDNA codificando um gene EGFP marcado histone 2B sob o controle de um promotor de actina G.bimaculatus é inserido no genoma do críquete usando transposase de piggyback, torna-se possível visualizar cada núcleo no ovo usando fluorescência para excitar a proteína hist 2B marcada pelo EGFP. Ajustar o equilíbrio para que as agulhas não obstruam é um passo crítico neste procedimento.
Você pode precisar fazer vários ajustes após as injeções subsequentes, uma vez que a gema às vezes entope a ponta da agulha. O críquete é um inseto hemimimeboloso que se ramifica basally para insetos holometabolos bem estudados, como drosophila. Estudar o desenvolvimento do críquete nos ajudará a entender mais sobre evolução e desenvolvimento em todo o reino animal.
Essa técnica requer alguma prática. Recomendamos praticar injeções de controle até que a taxa de sobrevivência quatro ou cinco dias após a injeção seja de pelo menos 80%
