Kardiyomiyopati gibi yenidoğan hastalıklarında, indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı hücreler kullanılarak rejeneratif tedavi nin büyük bir potansiyeli vardır. Ancak, in vitro hızlandırılmış hücre büyümesi reaktif oksijen türleri gibi birikmiş metabolitleri tarafından DNA hasarına yol açar. Bu DNA hasarlı hücrelerin nakli organın kötü engraftment ve rejenerasyon neden olur.
Transplantasyon dan önce hücrelerin kalitesi değerlendirilmelidir. Burada kök hücrelerdeki DNA hasarını değerlendirmek için adım adım iki protokol salıyoruz. Prosedürleri gösteren Jessica Miller, bir araştırmacı, Nikhil Mardhekar, bir araştırmacı ve Vasanthi Rajasekaran, bir laboratuvar teknisyeni olacaktır.
Başlamak için, DNA-RNA serbest su 100 mililitre düşük eriyen agarose 500 miligram yerleştirin. Agarose eriyene kadar bir mikrodalga fırında şişe ısıtın. Daha sonra, şişeyi 37 derecelik bir su banyosuna, ihtiyacı olana kadar yerleştirin.
Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız slaytları hazırlamak için, cam bir slayt üzerine % 0.5 agarose birkaç damla yerleştirin. Hemen bir coverslip kullanarak agarose kaplama ince bir tabaka oluşturmak için agarose yayıldı. Ultraviyole ışık kaynaklı hücre hasarını önlemek için düşük ışık koşullarında çalışarak, 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 90 mikrolitre agarose çözeltisini bir tüpte karıştırın.
Agarose'un katılaşmasını önlemek için tüpü 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Önceden kaplanmış kuyruklu yıldız kaydırağına hava kabarcıkları ve nokta başına 70 mikrolitre pipet vermeden çözeltiyi karıştırın. Bir pipet ucu kullanarak, ince bir tabaka oluşturmak için hücre agarose karışımı yayıldı.
15 dakika boyunca dört derece santigrat slayt yerleştirin. Bir kapta, tamamen soğuk lysis tampon slayt batırın. Bir saat için dört derece santigrat de karanlıkta konteyner yerleştirin.
Lysis tamponu soğuk alkali çözeltisi ile değiştirin. Slaytların tamamen batırılmış olduğundan emin olun. Konteyneri karanlıkta dört derece daha 30 dakika daha bıraktıktan sonra, kaydırağı yatay bir elektroforez tankına yerleştirin.
Kaydıralar tamamen batırılıncaya kadar tankı soğuk alkali elektroforez tamponuyla doldurun. Voltajı 15-30 dakika santimetre cinsinden uygulayın. Bir kapta, tamamen soğuk deiyonize su slayt batırın.
İki dakika sonra, deiyonize su çıkarın ve taze deiyonize su ekleyin ve sonra ikinci kez bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, soğuk% 70 etanol ile deiyonize su değiştirin. Beş dakika sonra, yavaşça yatırmadan slayt çıkarın ve kuru hava sağlar.
Kuruduktan sonra, her noktaya seyreltilmiş DNA boyası 100 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekleyin. Epifloresan mikroskobunda FITC filtresi kullanarak, numune başına toplam 50 ila 100 kuyruklu yıldızın görüntülerini alın. Kültür iPS kaynaklı kardiyomiyositler metin protokolünde açıklandığı gibi.
Oda slaytlarında iPS kaynaklı kardiyomiyositleri görmek için, önce kültür ortamını kuyulardan atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Kuyu başına 0.25% Trypsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 derece santigrat de kuluçka. Hücre kopması için mikroskop altında plakayı kontrol edin.
Sonra Trypsin durdurmak için CMM bir mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik bir tüp ve santrifüjü dört santigrat derecede beş dakika ve 200 kez yerleştirin. Orta atın, CMM bir mililitre ekleyin ve hücreleri yeniden askıya.
Hücreleri sayın ve cmm 1.6 mililitre iki milyon hücre elde etmek için hücre sayımları ayarlayın. Şimdi tohum sekiz kuyulu oda slayt kuyu başına hücre süspansiyon 200 mikrolitre. Hücreleri kuyunun etrafına yaymak için slayta hafifçe dokunun.
Hücreleri 37 derecede kuluçkaya yatırın. iPS kaynaklı kardiyomiyosit doksorubisin tedavisi için, iPS kaynaklı kardiyomiyosit kuyularından kültür ortamını atın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri tek mikromolar doksorubisin ile 37 santigrat derecede dört saat tedavi edin.
Ortamı aspire edin ve hücreleri PBS ile yıkayın. İmmünoetiketleme yapmak için hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve her kuyuya 200 mikrolitre taze hazırlanmış %4 paraformaldehit ekleyin. Oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca hücreleri düzeltin.
PBS ile hücreleri yıkadıktan sonra, kuyu başına engelleme tampon 200 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada 30 dakika boyunca blok. Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçkaya yattıktan sonra kuyuları PBS ile üç kez yıkayın.
PBS çıkarın ve ikincil antikor karışımı 200 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında koyu nemli bir odada 45 dakika kuluçka. Daha sonra pbs ile kuyuları üç kez yıkayın.
Antifade ile slaytlar montaj önce deiyonize su ile yıkayın. Bir kapak camı yerleştirin ve slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Konfokal mikroskop kullanarak, örnek başına rastgele alanların üç ila beş görüntüsünü alın ve görüntü analizine devam edin.
DNA hasar yanıt foci saymak için, indirin ve CellProfiler yükleyin. Dosyayı seçin, içe aktarın, dosyadan ardışık kaynak aktarın ve puncti gamma-H2AX adlı ardışık işlem dosyasını seçin. Gama-H2AX foci'nin edinilmiş görüntülerini içeren klasörü, analiz için giriş modülleri görüntüler bölümündeki dosya listesi penceresine sürükleyin ve bırakın.
Ardından metin protokolünde gösterildiği gibi yönergeleri izleyin. Görüntülerin parametrelerini ayarlamak için, analiz için istenen görüntüyü dosya listesine sürükleyin. Giriş modülleri altında görüntüleri seçin.
Ayrıca giriş modüllerinde, meta verileri seçin ve ardından adları ve türleri seçin. Gruplar için hayır'ı seçin. Analiz modüllerinde çalışırken, griden griye rengi seçin.
Ardından düzgün'ün, birincil nesneleri tanımlay'ı seçin ve yine düzgün'ün seçilmesini seçin. Sonraki özelliği geliştir veya bastır ve ardından birincil nesneleri tanımlay'ı seçin. Çözümleme modüllerinde çalışmaya devam ediyor, ilgili nesneleri seçin, ardından nesneleri sınıflandırın ve son olarak elektronik tabloya dışa aktarmayı seçin.
Görüntü analizi gerçekleştirmek için sol alt paneldeki görüntüleri analiz et'i tıklatın. Analizin başarıyla tamamlanmasıyla, çeşitli görüntüler oluşturulur. Bilgisayarda oluşturulan ve kaydedilmiş CSV dosyasına dikkat edin.
Bu dosya daha fazla analiz için nicel verileri içerir. Deneme resmim olarak adlandırılan elektronik tabloda, B sütununda beş puncti'ye kadar olan çekirdek sayısı, D sütunu ise beşten fazla puncti olan çekirdek sayısına sahip olacaktır. Toplam çekirdek sayısını elde etmek için B ve D sütunlarını ekleyin.
Tüm görüntüler için bu adımları yineleyin, her analizden önce deneme dosya adımı değiştirin. Burada dokso ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen iPS hücrelerinden kuyruklu yıldızların temsili mikrografları gösterilmiştir. DNA hasarı ve kuyruk momentinin bir kısmı olarak ifade edilen iPS hücrelerinde bazal miktarda DNA hasarı bulundu.
Ancak, dokso tedavisi beklendiği gibi iPS hücrelerinde DNA hasarı arttı, kuyruklu yıldız testi pluripotent kök hücrelerde DNA bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılabilir gösteren. Gamma-H2AX immünetiketlemenin temsili mikrografları burada, daha düşük büyütmede ve daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Kontrol iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde, hücrelerin %90'ından fazlasının çekirdekbaşına beş DDR foci'den daha az olduğu görülür.
Ve hücrelerin %10'undan azında çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Altı ay boyunca kültüre sahip iPS kaynaklı kardiyomiyositler için, hücrelerin %90'ından azında çekirdek başına beş DDR foci ve toplam da %13'ten fazla çekirdek başına altı DDR foci vardı. Dokso-tedavi edilen iPS kaynaklı kardiyomiyositlerde ise, hücrelerin %80'inden azında çekirdek başına beş DDR foci vardı.
Ve hücrelerin yaklaşık %24'ünde çekirdek başına altıdan fazla DDR foci vardı. Bu veriler, uzun süreli iPS kaynaklı kardiyomiyosit hücre kültürü ve dokso tedavisinin önemli DNA hasarına yol açarak hücre nakli için uygun olmadığını göstermektedir. Bu elektroforez etkileyebilir gibi hücre süspansiyon karıştırırken değişkenleri önlemek için çok önemlidir.
Bu prosedürü takiben, kuyruklu yıldız tahlilleri ve çeşitli hücreler ile immünetiketleme prosedürleri gerçekleştirebilirsiniz. Bu teknikler, hücre nakli çalışmalarında kullanılmadan önce çeşitli türdeki hücrelerin DNA hasarı açısından değerlendirilmesine olanak sağlayacaktır.
