Bu yöntem araştırmacıların mitokondriyal fonksiyondan bağımsız olarak hücresel canlılığı değerlendirmelerine olanak sağlayacaktır. Ve yüksek iş kadar uyuşturucu tarama çabalarına uygun. Bu teknik hızlı, doğru, ucuz, ve bileşiklerin sitotoksisite belirlenmesini sağlar, bu çoğu hücre tiplerinde mitokondriyal fonksiyon bozan dahil.
Bu protokolü gerçekleştirmek kolaydır. Deneysel doğruluk ve geçerliliği sağlamak için ilaç hazırlama, tedavi koşulları ve hücre yoğunluğuna dikkat etmek önemlidir. Görüntü edinimi ve görüntü analizi adımlarını özetlemek zor olabilir, çünkü özellikle Gen5 Software ile çok az deneyime sahip araştırmacılar için bu yöntemin görsel gösterimi önemlidir.
İstenilen konsantrasyonda ilgi bileşiklerinin çözeltilerini hazırlayarak başlayın. Her zaman iyice girdap tarafından bileşikleri karıştırmak için emin olun. Tek bir bileşiğin sitotoksisitesini ölçmek için, bileşikleri 2X son konsantrasyonda hazırlayın.
Bileşik kombinasyonların sitotoksisitesini ölçüyorsanız, 4X son konsantrasyonda hazırlayın. Çözücü kontrollerini yalnızca aynı miktarda çözücüile uygun ortama karıştırarak hazırlayın. Hücreleri 15 mililitrelik konik tüpe toplayın ve hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın.
Trypan mavi boyama için, aliquot için 0.4% trypan mavi 10 mikrolitre ekleyin ve canlı ve canlı olmayan hücreleri saymak için bir hemositometre veya hücre sayacı kullanın. Pelet hücreleri 15 mililitrelik tüpte 200 kez G beş dakika, sonra aspire veya supernatant decamped. Biz mililitre başına beşinci hücrelere üç kez 10 bir hücre yoğunluğu uygun medya da hücre pelet askıya.
96 kuyu plakasının her bir kuyunun içine 50 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumu için çok kanallı bir pipet kullanın. Tek bileşik tahliller için, her kuyuya 50 mikrolitre 2X bileşik çözeltisi ekleyin. Solvent kontrol kuyuları için, 2X konsantrasyonunda çözücüiçeren 15 mikrolitre test ortamı ekleyin.
Kombinasyon tahlilleri için her bir kuyuya 4X bileşiklerin her biri 25 mikrolitre ekleyin. Tek bileşik kontrol kuyuları için, 4X bileşik çözeltisi ve test ortamının her biri 25 mikrolitre ekleyin. DMSO'nun nihai konsantrasyonunun %0,5'i geçmediğinden emin olun Tekrarlanabilirliği sağlamak için, kuyuların yan tarafına dokunan pipet uçları yla ilaç ekleyin.
Farklı yerlere ilaç eklemek için dikkatli olmak. Bu bıçaklar çok hızlı bir şekilde, tercihen plaka başına en fazla 30 dakika sürer yapılmalıdır. Yavaşça kuyuların içeriğini karıştırmak için plaka dokunun ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit kuluçka.
Hoechst 33342 ve propidium iyodür ile hücreleri lekelenmeye hazır olduğunda taze 10X boyama çözeltisi hazırlayın ve her kuyuya 10 mikrolitre ekleyin. Yavaşça plaka dokunun ve 15 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Plakayı 200 kez G'de dört dakika santrifüj edin ve tüm hücreleri tabağın dibine getirin.
Daha sonra dikkatlice görüntüleme ile müdahale edebilir herhangi bir enkaz kaldırmak için nemli bir laboratuvar mendil ile plakanın alt silin. Santrifüjden sonra plakayı 15 dakika içinde görüntüleyin. Gen5 Yazılım'ı açın ve yeni bir standart protokol oluşturun, Yordam'a tıklayın ve kullanılacak plaka türünü seçin.
Genellikle, 96 iyi siyah plastik plakalar. Ardından, okuma yöntemini görüntüye ayarlayın, Tamam'ı tıklatın ve 4X büyütme hedefiyle DAPI ve Teksas Kırmızı Filtre kümelerini seçin. Kuyu merkezleri görüntülenecektir, çünkü hiçbir ofset gereklidir.
DAPI filtresi için LED'i 10'a, tümleştirme süresini 99'a ve kazancı sıfıra ayarlayın. Texas Red için, sekiz LED ayarlayın, 950 entegrasyon süresi, ve kazanç 18. Otomatik odaklamanın DAPI kanalında gerçekleştirildiğinden ve kanallar arasında odaklamada ofset olmadığından emin olmak için Seçenekler'i tıklatın.
Tamam'ı tıklatarak protokolü kaydedin. Artık görüntüler Yeni Oku düğmesini kullanarak kaydedilebilir. Görüntüler kaydedildikten sonra Veri Azaltma'yı tıklatın ve Resim Ön İşleme'yi seçin.
DAPI sinyalini temel alan Otomatik düzilme boyutunu kullanarak koyu arka plan çıkarma ile Görüntü Önİşleme uygulayın. Texas Red için Kanal 1 ile aynı seçenekleri kullanın. Bittiğinde Tamam'ı tıklatın.
Daha sonra hücresel analiz paneline gidin ve 6,000 birim eşik değeri, beş mikrometre minimum nesne boyutu ve 25 mikrometre maksimal nesne boyutu ile dönüştürülmüş DAPI sinyaline dayalı bir Nükleer Maske uygulayın. Görüntünün tamamını analiz edin, görüntünün kenarındaki birincil kenar nesnelerini hariç tonuyla dışleyin ve dokunma nesneleri bölün. Gelişmiş algılama seçeneklerinde, yuvarlanan top çapını 30 mikrometre olarak ayarlayın ve arka planı en düşük piksellerin %5'ine göre değerlendirin.
Hücre sayısını yalnızca hesaplanan ölçümlerde tutun. Bundan sonra, ölü hücreleri saymak için 5.000 birim eşik değeri ile ortalama dönüştürülmüş Texas Red sinyaline dayalı bir alt popülasyon analizi gerçekleştirin. Son olarak, ortaya çıkan hücre sayımları erişin.
Hoechst, propidium iyodür ile boyanmış hücrelerin temsili görüntüleri burada gösterilmiştir. Toplam hücre sayısı oldukça yüksek ve ölü hücre sayısından daha fazladır. Sitotoksisite tahlilleri bir panel trypan mavi dışlama ile karşılaştırıldığında, bu MTT ve Alamar mavi tahliller yanlış hücresel canlılık ölçülen bulundu.
Bu mitokondriyal enzim bazlı tahliller trypan mavi salgılamaya göre önemli ölçüde daha düşük canlılık gösterdi. Hoechst 33342 ve PI ile çift boyama sağlamlık, duyarlılık ve trippan mavi boyama ve CCP veya 2-DG tedavi sonrası trypan mavi dışlama yönteminden en küçük medyan sapma ile tutarlılık en iyi kombinasyonu vardı. Hoechst PI denemesi aynı zamanda rotenone ve üç bromopyruvat molekülünü hedefleyen mitokondri ile tedavi sonrası hücresel canlılığı belirlemede de etkili oldu.
Daha fazla lösemi hücre hatları bir panel ile doğrulandı. Bu hücreler çok hassas tan direnç hücrelerine kadar rotenon duyarlılığı nda farklılık gösterirler. Tazbın yanlış performansı doğruluğundan ödün verebilir.
Birkaç uzlaşma sonuçları burada gösterilir. PI ile aşırı boyama, santrifüj adım ihmal, veya Hoechst kanalaşırı pozlama, suboptimal sonuçlara neden olacaktır. Bu protokolü zamanlama sırasında, her hücre hattı için boya konsantrasyonu ve boyama süresini optimize etmeyi unutmayın.
Ayrıca, bir örnek plaka için santrifüs, görüntüleme kalitesini sağlamak için gereklidir. Kanser hücreleri üzerinde sitotoksisite etkisi bileşiklerin belirlenmesinden sonra, araştırmacılar ilgili hedefleri belirlemek için mekanistik çalışmalar ile devam edebilir. Küçük molekül kütüphaneleri geleneksel MTT tahlillerine paralel olarak bu teknikle taranması, mitokondriyal fonksiyonu hedefleyen moleküllerin hızla tanımlanmasını sağlayacaktır.
