우리의 프로토콜은 고동적인 세포 과정 및 상세한 세포 구조를 연구하기 위하여 생리적인 조건에서 심상화세포를 유지하는 정규 불소 포프로브 및 간단한 견본 준비 기술을 이용합니다. 이 기술은 우리가 특별하거나 임시 해상도 중 하나를 희생하지 않고 장기간 동안 슈퍼 해상도와 생리 적 조건에서 세포 과정을 조사 할 수 있습니다. 12~14킬로달톤의 분자량 차단 투석 막을 작은 조각으로 자르고 약 5분 동안 100마이크로리터의 살아있는 세포 배지로 조각을 담그십시오.
멤브레인이 몸을 담그는 동안 50 밀리리터 튜브의 외부 링을 작은 조각으로 자르고 조각을 70 % 에탄올로 소독합니다. 고환해부 및 장착의 경우, 10 2~3일 된 마취된 남성이 해부 현미경하에서 해부 접시에 파리를 옮기고 미세 한 집게를 사용하여 고환을 제거하십시오. 모든 고환이 수집되면, 살아있는 세포 배지에서 고환을 두 번 세척하고 파이펫 팁을 사용하여 100 에서 150 마이크로리터의 살아있는 세포 배지를 준비된 유리 바닥 접시에 퍼뜨리게 한다.
미세 한 집게를 사용하여 비행 고환을 접시의 중심으로 옮기고 매체의 약 10 마이크로 리터를 제외한 모든 것을 제거하십시오. 빨리, 고환에 미리 젖은 멤브레인을 배치하고 멤브레인에 2 ~ 3 개의 작은 플라스틱 무게를 놓습니다. 즉시 신선한 라이브 셀 배지 100~150마이크로리터를 추가하고 링을 접시의 높은 측면에 다시 놓습니다.
덮개를 다시 링에 놓고 종이를 덮개 슬립에 놓기 전에 티슈 페이퍼를 물에 휘둘러 놓습니다. 그런 다음 뚜껑으로 접시를 덮고 슈퍼 해상도 현미경의 무대에서 접시를 고정하십시오. 생식선 줄기 세포 이미징의 경우 이미징 소프트웨어를 열고 전달된 빛을 켭니다.
63X 목표를 사용하여 고환 조직에 집중하고 레이저를 켭니다. 생검 줄기 세포를 찾으려면 라이브"를 클릭합니다. 포커스를 조정하고 프레임 크기를 클릭"하여 프레임 크기를 512x512x 1024픽셀로 설정하고 평균화"를 설정하여 프레임 평균을 하나 또는 두 개로 설정합니다.
마스터 게인을 클릭하여 전자곱게인을 800 미만으로 설정하고, 레이저"는 레이저 전력을 지역 또는 관심 셀로 1%에서 2%로 확대하여 이미지 획득 시간을 줄이고 사진 표백을 줄이고, 시작 실험을 클릭하기 전에 이미지가 최적으로 구성되었는지 확인하여 타임랩스 영상 캡처를 시작합니다. Airyscan 획득이 최적으로 구성되지 않은 경우"가 표시되고, 프레임 크기, Z-스택 및 스캔 영역 섹션에서 최적의"을 클릭하고, 실험 설계 및 시편의 유형에 따라 시간 간격, Z 슬라이스 수 및 시간 경과 이미징의 기간을 최적화합니다. 이미징 후 처리, 배치 및 Airyscan 처리를 선택하고 처리할 이미지를 선택합니다.
그런 다음 프로세스 실행"을 클릭하여 슈퍼 해상도 이미지를 얻습니다. 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 초기 단계 세균 세포에서 알파 tubulin GFP를 표현하는 drosophila 고환의 살아있는 세포 화상 진찰은, 어머니 중심에서 밝은 신호로, 2 개의 센트로솜에서 GFP 신호의 비대칭 강도의 시각화를 허용하고 딸 중원에서 상대적으로 약한 신호로. 밝기의 차이는 미세투막 핵의 측두체 비대칭에 의해 반영될 가능성이 높지만, 미세투부의 상세한 형태와 양은 회전 디스크 공초점 현미경 검사를 사용하여 해결할 수 없다.
대조적으로, 살아있는 세포 슈퍼 해상도 화상 진찰은 microtubule 형태와 숫자의 시각화 그리고 정량화를 허용합니다. 이 향상된 해상도는 또한 비대칭 미세tubule 핵의 패턴을 보여줍니다, 신장과 핵 막과의 증가 상호 작용. 살아있는 세포 화상 진찰은 또한 비대칭 핵막 질의 시각화를 허용합니다, 그러나 직접 핵을 입력하는 개별 적인 microtubules의.
대조적으로, 이 살아있는 세포 슈퍼 해상도 기술은 마이크로투부와 핵 라미나 둘 다의 동시 화상 진찰에 의해 이 사건의 직접적인 관찰을 허용합니다. 메타단계에서는, 두 자매 중심엽골은 현미경 을 방사능 디스크 현미경검사법을 사용하여 하나의 신호로 검출될 수 있습니다, 마이크로투블러 중앙 부착을 관찰할 수 없지만. 대조적으로, 슈퍼 해상도 라이브 이미징은 초기 단계에서 마이크로 튜블러 중심의 부착물의 시각화를 허용합니다.
고환 위에 멤브레인을 배치하여 이미징 중에 움직이거나 떠다니지 않도록 하고 사진 표백 및 사진 독성을 피하기 위해 현미경 설정을 최적화해야 합니다. 단백질 역학, 선형 응력 또는 세포 방어 및 프로세스를 조사하는 것과 같은 이 방법이 적용될 수 있는 여러 가지 방법이 있습니다.
