Bakteriyel CRISPR-Cas9 sistemi yaşam bilim adamları için deneysel seçenekleri önemli ölçüde artmıştır. Ancak, birkaç CRISPR yaklaşımı birden fazla kılavuz RNA'nın tek tek hücrelere eşzamanlı olarak teslim ini gerektirir. String montaj gRNA klonlama tek bir klonlama adımında çok katlı gRNA ifade vektörlerinin basit ve hızlı bir şekilde üretilmesine olanak tanır.
Ama STAgR sadece basit değil, aynı zamanda verimli, ucuz, ve özelleştirmek kolaydır. Başlamak için, STAgR DNA dizesi için n20 gRNA dizilerini çıkıntı olarak ileri amplifikasyon astarlarına ekleyin. Geleneksel bir iskele için ileri astar, İskele ileri astar, veya MS2 içeren bir iskele için SAM ileri astar için anlamlı gRNA dizileri beş asal ekleyin.
Daha sonra, kullanılan belirli organizatörlere ve dizelere bağlı olarak RP astarlarını seçerek ters astar dizilerine N20 gRNA dizilerini ters tamamlayın. Gibson Assembly için bireysel klonlama parçaları oluşturmaya başlamak için, bir tüp için yüksek sadakat tampon 10 mikrolitre aktarın. 10 milimolar dNTPs bir mikrolitre ve her iki 100 mikromolar çıkıntı astar 0.25 mikrolitre ekleyin.
DNA şablon dizesi veya vektör 10 nanogram ve DMSO 1,5 mikrolitre ekleyin. Son hacmi 49,5 mikrolitreye çıkaracak kadar su ekleyin ve 0,5 mikrolitre HF polimeraz ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi, reaksiyonları bir termocycler üzerinde kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, PCR reaksiyonundan 5,5 mikrolitre aliquot alın. Tüm aliquots yükleme boya ekleyin ve% 1 agarose jel üzerine yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin ve jeli 120 voltta uygun bir jel çalıştıran tamponda 30 dakika çalıştırın.
Jel çalışırken, kısıtlama enzimi ile sağlanan tampon beş mikrolitre ekleyin, ve 0.5 mikrolitre DpnI kalan 44.5 vektör PCR reaksiyonpcr sırasında kullanılan artık plazmid şablonu kaldırmak için. 37 derecede 30-60 dakika kuluçkaya yat. Amplicons doğru boyutta olduğundan emin olun.
DNA arınmasını başlatmak için, bir mikrolitre PCR ürününe 1,8 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. İki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yat. Bir mıknatıs kullanarak, DNA parçalarındaki boncukları artık sıvıdan ayırın.
Boncukları yıkamak için peleti %70 etanolile tamamen yeniden sumadan durula. Bu yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Bir pipet kullanarak, tüm etanol çıkarın ve pelet hava kuru izin.
Sonra 15 ila 20 mikrolitre su ekleyin ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve pelet eritmek için. Sıvı boncuk ayırmak için bir mıknatıs kullanın. Berrak süpernatant'ı yeni bir tüpe aktarın.
Bundan sonra, DNA konsantrasyonlarını belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. İlk olarak, metin protokolünde ayrıntılı olarak 5x isothermal reaksiyon arabelleği hazırlayın. Gibson Assembly Master Mix için, su 697 mikrolitre ile 5x isothermal reaksiyon tampon 320 mikrolitre birleştirir.
3 mikrolitre T5 ekonülaz, 20 mikrolitre DNA polimeraz ve 160 mcirolitre Taq DNA ligaz ekleyin. Assembly Master Mix'in 7,5 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi vektöre 2,5 mikrolitre ekleme ekleyin.
Örnekleri 50 derecede 45-60 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, sonraki dönüşüm için örnekleri buzüzerinde veya 20 santigrat derecede saklayın. Bakterileri dönüştürmeye hazır olduğunuzda, buz üzerinde Kimyasal Olarak Yetkin TOP10 E.Coli bakterisini eritin.
Sonra, yetkili bakterilerin 50 mikrolitre Gibson Mix beş mikrolitre ekleyin ve yavaşça tüp alt flicking tarafından karıştırın. 30 dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Bakterileri ısı şoketmek için tüpü 42 derece lik su banyosuna veya ısı bloğuna 45 saniye yerleştirin.
Sonra tüpleri tekrar buza koy. Bakterilere 250 mikrolitre SOC orta ekleyin ve 30 ila 45 dakika boyunca sallayarak bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede iyileşmelerine izin verin. Bakteriler iyileştikten sonra, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren %1,5 LB Agar plakaları üzerine plakalayın.
Plakaları gece boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Başlamak için, her yapı için 200 mikrolitre PCR reaksiyon tüpleri en az iki set hazırlamak. Ampisilin mililitre başına 100 mikrogram içeren 100 mikrolitre LB orta ile reaksiyon tüpleri setleri birini doldurun.
Steril pipet ucu kullanarak, bir bakteri kolonisindeki biyolojik materyali kazıyın ve boş bir 200 mikrolitrelik PCR reaksiyon tüpünün altına yayın. Pipet ucunu derhal LB orta içeren ikinci ilgili reaksiyon tüpüne aktarın. Bazı bakterilerin LB ortama aktarıldığından emin olmak için ucu etrafında swirl.
Daha sonra kullanmak için 37 santigrat derecede kuluçka. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, reaksiyon tüpü başına 10 mikrolitre PCR Master Mix hazırlayın. LB ortam olmadan, etiketli PCR reaksiyon tüplerine 10 mikrolitre PCR Master Mix ekleyin.
Bir termocycler kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi reaksiyonları kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, yükseltilmiş parçalara yükleme boyası ekleyin ve %1 agarose jel üzerine yükleyin. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yükleyin ve jeli 120 voltta uygun bir jel çalıştıran tamponda 30 dakika çalıştırın.
Kullanılan organizatörlerin, gRNA iskelelerinin ve N20 dizilerinin sayısını tek tek boyutlarını ekleyerek amplicon'un teorik boyutunu hesaplayın. Koloni PCR sonuçlarından, doğru bant boyutuna göre bakteriyel klonları belirlemek, ve doğru vektörleri barındırma olasılığı olup olmadığını. Karşılık gelen 100 mikrolitre kültürü kullanarak, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren bir 2.5 mililitrelik lb kültürü aşılamak.
12 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre plazmid DNA'sını çıkarmak için ticari bir plazmid mini kiti kullanın. Bu yordamda, string montaj gRNA klonlama hızlı bir şekilde gRNA ifade plazmidleri oluşturmak için kullanılır.
STAgR parçalarını elde etmek için kullanılan PcR'lerin tipik bir sonucu burada görülmektedir. Altı amfuz, her biri uçlarında tek tek gRNA N20 dizileri içeren doğrusal DNA parçalarını temsil eder. Plazmid omurgagNA1 ve gRNA6 hedefleme dizileri ile genişletilmiş ve bu nedenle Gibson Assembly için diğer iki PCRs için gerekli çakışmalar sahip.
Arınma sonrası, vektörler ve kesici uçlar için en az bir mikrogram DNA verimi elde edilebilir. Gibson Montaj sonra, bakteri dönüşümü 100-700 bakteri kolonileri sonuçlanır. Altı gRNA kasetli STAgR protokolünden sonra koloni PCR aracılığıyla 22 bakteri kolonisinin temsili analizi, yedi klonun tam montaj için beklenen amplicon boyutunu gösterdiğini göstermektedir.
Diğer klonlar büyük olasılıkla bir ila beş gRNA kasetiçeren STAgR vektörleri aldı, bir klon ise tamamen boş. Bir kez hakim, bu teknik birkaç saat içinde yapılabilir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse, bir çalışma haftasından daha kısa bir sürede çok sayıda çok sayıda gRNA ifade vektörü oluşturmanızı sağlar.
Bu yordamı denerken, doğru atama ve N20 çıkıntı astar kombinasyonu dikkat etmek önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, kendi çok katlı kılavuzu RNA ifade vektörleri oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
