Bu yöntem, CRISPR tarafından kolaylaştırılan denemeler için kılavuz RNA ekspresyonu plazmidlerinin oluşturulmasını kolaylaştırır. Bu tekniğin en büyük avantajı klonlamanın tek bir adımda gerçeklenebilen ve eşleştirilmiş kılavuz RNA'ların tek kılavuzlu RNA ekspresyonu plazmidleri kullanılarak oluşturulabiliyor olmasıdır. Bu protokolü başlatmak için, 1X TE tamponly lyophilized astarlar 100 mikromolar son konsantrasyonu seyreltmek.
Aliquot PCR şerit kapak tüpleri içine ileri ve ters astar eşit miktarda. Girdap karıştırmak için. Daha sonra, 15 saniye boyunca 100 kez G kılavuzu RNA oligonükleotid karışımları aşağı spin.
Ligasyonu ayarlamadan önce reaksiyonu oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Seçilen PSB700 kılavuz ifade vektörünün bir ila beş mikrogramını bsnb1'e bir mikrogram ı bir mikrogramı için 0,5 mikrolitre BSNB1 kullanarak ekleyin. Toplam hacmi 40 mikrolitre olana kadar distile su ekleyin ve 55 santigrat derece bir saat boyunca sindirim yapmak.
% 1.5 düşük eriyen agarose jel üzerinde sindirim ürünleri çalıştırın. Yaklaşık 9 kilobaz büyüklüğünde bir parçaya karşılık gelen sindirilmiş vektör omurga bandını kesin. Bu jel dilimini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın.
Ticari bir jel arıtma kiti kullanarak, üreticinin talimatlarına göre agarose jel DNA ayıklayın. Daha sonra konsantre bir elute elde etmek için 10-15 mikrolitre TE tampon içine DNA seyreltin. Ligasyon yapmaya hazır olduğunuzda bir şişeye 15 mikrolitre distile su ekleyin.
Daha önce anneleştirilmiş kılavuz RNA oligonükleotidlerin 1 mikrolitresini, BSNB1 sindirilmiş PSB700 kılavuz ekspresyon vektörünün bir mikrolitresini ve 2 mikrolitre 10XT4 DNA ligaz reaksiyon tamponu ekleyin. Sonra girdap bu çözeltiyi karıştırın. Bir mikrolitre DNA ligaz ve girdap tekrar ekleyin.
Çözeltiyi 15 saniye boyunca 100 kez G'de aşağı doğru çevirin. Gece boyunca oda sıcaklığında reaksiyonları kuluçkaya yatırın ve bsnb1 sindirilmiş vektörü tek başına bir kılavuz RNA oligote ekleme olmadan hiçbir kesici uç negatif kontrol reaksiyonu içerdiğinden emin olun. Başlamak için, E.coli'yi eksi 80 derecede depodan çıkarın ve 5 ila 10 dakika buzda eritin.
Sekiz mikrolitre yetkili E.coli'ye hazırlanan reaksiyon karışımının 0,5 mikrolitresini ekleyin. Karışımı 30 dakika buzda bekletin. 42 santigrat derecede 45 saniye boyunca karışımı ısı şoku.
Daha sonra karışımı niçin buz üzerinde iki dakika dinlendirin. Bir döner shaker kullanarak, NEB DH5a veya NEB Stables için burada listelenen koşulları kullanarak SOC medya 250 mikrolitre kültürü kurtarmak. Bundan sonra, uygun bir antibiyotik direnci lysogeny suyu plaka üzerinde kültürün plaka 80 mikrolitre.
NEB DH5a için bir gecede 37 santigrat derece veya NEB Ahırları için 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi gerekli parçayı oluşturmak için Phusion GC özel PCR protokolünü kullanın. Bu PCR ürününü %1'lik bir agarose jel üzerinde çalıştırın ve bir bandın yaklaşık 490 baz çiftinde görüldüğünü doğrulayın.
Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak kesilmiş ve bu PCR ürün ayıklamak. Sonra PCR tüpler içine hazırlanmış bir 1X ana karışımı aliquot. Mikrolitre başına 40 femtomol konsantrasyonunda PCR ürün bir mikrolitre eklemek için çok kanallı pipet kullanarak.
PSB700 vektörünün bir mikrolitresinde mikrolitre başına 40 femtomol konsantrasyonu eklenir. Kılavuz RNA oligonükleotidler yerine bir mikrolitre su kullanarak hiçbir kesici uç kontrolü ekleyin. Vektörü sindirin ve metin protokolünde özetlenen Golden Gate protokolünü kullanarak tek bir reaksiyondaki uçları indirin.
İlk altın kapı reaksiyonundan sonra her reaksiyona BSNB1 enziminin 0,5 mikrolitre ilavesi eklenir. Reaksiyona bir saat boyunca 55 derecede devam edin. Altın kapı reaksiyonu tamamlandığında daha önce açıklanan E.coli dönüşüm sürecine devam edin.
Bu çalışmada, tek kılavuz RNA ifade vektörleri başarıyla iki yöntem kullanılarak oluşturulur. İlk yöntemde vektör omurgası önceden sindirilir ve bir dizi kısa oligonükleotid ile bağlanır. İkinci yöntem aynı anda sindirmek ve tek bir reaksiyon da ligate altın kapı klonlama kullanılır.
Eşleştirilmiş kılavuz RNA ifade vektörleri, her biri kendi bağımsız organizatörü tarafından tahrik başarıyla özel bir PCR parçası klonlama oluşturulur. Bu yöntemlerden herhangi biri için başarılı klonlama, hiçbir kesici uç kontrol plakası ile karşılaştırıldığında uygun kesici DNA ile dönüşümler için önemli ölçüde daha fazla koloninin ortaya çıkmasına neden olacaktır. Bu yordamı denerken, klonlama adımınıza ekleme denetimi eklemeyi unutmayın.
Bu prosedürü takiben, kromatin imzalarının gen ekspresyonu üzerindeki etkileri gibi soruları cevaplamak için epigenom mühendisliği gibi başka yöntemler de uygulanabilir.
