Külleme önemli bir bitki hastalığıdır. Hastalık fenotipinin doğru belirlenmesi, patojenin aşılanmasını bile gerektirir. Mevcut yöntemler verimsiz olduğundan, bu protokolü geliştirdik.
Spor aşılama yöntemimiz aşılamayı bile kolayca sağlayabilir ve basit ve ölçeklenebilir. Bu nedenle, külleme ile çalışan herhangi bir laboratuvar bu yöntemi kolayca kullanabilir. Araştırmacılar ayrıca bir karton kutunun üzerine ağ monte edebilir ve spor aşılaması için kullanabilirler.
Sporların yerinden çıkarılması ve ağ yoluyla nasıl fırçalanacağı kritik bir adımdır. Bu yüzden bunu videoda göstermek çok yardımcı olabilir. Bu protokol için, 50 mikrometre naylon membran ağı veya 48 mikrometre paslanmaz çelik örgüden oluşan bir rulo alın.
Bir aşılama kutusu yapmak için büyük boyutlu, orta yoğunluklu kontrplakları 24.5X10 inç ve 12X10 inç parçalara ayırın. Bir ağ ile çıkarılabilir bir üst kapak yapmak için, uzun ahşap kare dübelini 26 inç ve 12.75 inçlik iki sete kesin. Kutunun etrafına sığacak şekilde dört parçayı yapıştırın ve çivileyin.
Akrilik levhaları alın ve sekiz köşe kelepçesi kullanarak tüm akrilik tabakaları bir kutuya monte edin. Kutunun akrilik tabakasının ön tarafındaki 7X2 inçlik bir açma penceresini kesin. Taze külleme sporlarını inoküla olarak hazırlamak için, altı ila sekiz hafta boyunca 22 santigrat derece ve% 65 bağıl nemde bir büyüme odasında temiz Arabidopsis bağışıklık sistemi baskılanmış pad4-1 mutant bitkileri yetiştirin.
Standart dairelerde enfeksiyon fenotiplerini belirlemek için bitkileri büyütün. Yeterli taze külleme sporları oluşturmak için pad4-1 bitkilerinin bir veya yarısını aşılayın. Enfekte olmuş bitkilerden taze sporlar mevcut olduğunda, bir enfeksiyon testi için aşılama odasının içindeki aşılama kutusuna bir düzlük bitki taşıyın.
15 ila 20 ağır enfekte Arabidopsis yaprağını kesin ve yoğunlaştırılmış su varsa kurumasını bekleyin. Bir çift uzun forseps ile bir ila iki yaprağı bir elinizde baş aşağı tutun. Daha sonra her iki elinizi de odanın açıklığından geçirin ve forsepsin koluna bir çift makasla hafifçe vurun, yaprakları aşılama kutusuna monte edilmiş ağın üzerinde yavaşça hareket ettirin.
Sporların bitkilere eşit dağılımını en üst düzeye çıkarmak için sporları ince fanlı blender fırçalarıyla tüm ağ yüzeyi boyunca farklı yönlerde fırçalayın. Ağa sıkışmış sporları sallamak için ağı fırçalarla birkaç kez hafifçe okşayın. Sporlar yerleştikten sonra, aşılanmış bitkileri içeren düzlüğü aşılama kutusundan çıkarın.
Daireyi plastik bir kubbe ile örtün ve 22 santigrat derece ve% 65 bağıl nemde bir büyüme odasına yerleştirin. Hastalık fenotiplemesi, aşılamadan 5 veya 8 ila 12 gün sonra yapılabilir. Karton kutuları, kutunun üst ve alt taraflarını çıkararak, sıkıştırmak için köşeyi bantlayarak ve üstüne yapıştırıcı ile 50 mikrometrelik bir ağ monte ederek bir aşılama kutusuna dönüştürün.
Bitkileri içeren düzlüğü aşılama odasının içine taşıyın ve bitkileri örtmek için daha küçük aşılama kutusunu dairenin üzerine yerleştirin. Sonra sporları yerinden çıkarın ve fırçalayın. Petri kabından biraz daha büyük bir mini aşılama kutusu yapın.
Plakaları kullanana kadar buzdolabında dört santigrat derecede saklayın. Test edilecek her bitki için yaprak sapının tabanından bir veya iki tamamen genişlemiş yaprak kesin. Ayrılan yaprakların yaprak sapını agar ortamına 30 derecelik bir açıyla yerleştirin.
Aşılama odasının içindeki yaprakları aşılayın ve plakayı kapakla birlikte bir büyüme odasına taşıyın. Enfeksiyon fenotiplerini değerlendirmek için, yaprakları aşılamadan dört veya beş gün sonra taze bir aseptik MS agar plakasına aktarın. Yaprakları taze agar ortamına sokmadan önce yaprak sapının tabanını kesin.
Aşılamadan sekiz veya dokuz gün sonra hastalık fenotiplerini değerlendirin. Mikroskobik analiz, düzlüğün altındaki mikroskobik slaytlar üzerindeki sporların eşit dağılımını gösterdi. Işık aşılamalarından sonra altı farklı yere dağılmış olan sporların hesaplanan yoğunluğu, önemli bir fark göstermedi.
Sporlarla yapılan ağır aşılamaların ardından da benzer sonuçlar elde edildi. Aşılama düzgünlüğü, ağır aşılamadan 12 gün sonra farklı bitki genotipleri arasında incelendi. Pad4-1 bitkileri, vahşi tip bitkiler olan Columbia 0'a kıyasla daha fazla hastalık duyarlılığı gösterdi.
Aşılamadan yaklaşık 10 gün sonra, duyarlı bitkilerde üretilen yeterli taze sporların kullanılması önemlidir, çünkü taze sporların yerinden çıkması daha kolaydır ve kolonizasyon oluşturma olasılığı daha yüksektir. Külleme sadece bitki epidermal hücrelerini kolonize eder. Epidermisin soyulması veya lazer mikro diseksiyonu ile külleme ile enfekte olmuş hücrelerin izolasyonu, konakçı yanıtlarının daha hedefli bir transkriptomik ve proteomik çalışmasını sağlayacaktır.
Bu yöntem, araştırmacıların toz küf enfeksiyonu fenotiplerini daha verimli bir şekilde belirlemelerine yardımcı olacak ve bu nedenle bitki külleme etkileşimleri üzerinde daha etkili fonksiyonel çalışmaları kolaylaştıracaktır.
