Bu prosedürün amacı, Protein Arginin Metiltransfenaz ailesinin bireysel üyelerinin hücrelerdeki enzymatic aktivitesini ölçmektir. Aktivite, arginin metilasyon düzeyleri ve toplam biyo-marker protein düzeyleri nicel floresan batı şişkinliği kullanılarak belirlenir. Açıklanan yöntemin avantajı, hücre kültürüne ve floresan Batı blot yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvardaki basit performanstır.
Makalede biyo-belirteçler, antikorlar ve inhibitör iki bileşik ile ilgili ayrıntılı yönergeler verilmiştir. Ve burada deneysel prosedürde yer alan önemli adımları anlattık. Ve prosedür 24 kuyu formatı için gösterilmiştir.
İlk olarak, lizis tamponu hazırlayın, kullanmadan önce taze benzonaz ve protein inhibitörü kokteyli ekleyin. Kuyulardaki tüm ortamları kaldırın. 100 mikrolitre PBS ile yıkayın ve kuyuya 60 mikrolitre lizis tamponu ekleyin.
Lizis tamponu hücrelere dağıtmak için plakaları sallayarak oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra% 1 konsantrasyon bulmak ve hafifçe sallayarak karıştırmak için% 20 SDS'nin üç mikrolitresini ekleyin. Lysate'i Eppendorf tüplerine aktarın ve buzda tutun.
BCA protein test kiti kullanarak numunelerinizin protein konsantrasyonunu belirleyin veya çözeltide% 1 SDS'yi tolere eden başka yöntemler kullanın. Lizis tamponlu protein konsantrasyonunun numuneler arasında eşit olacak şekilde ayarlandıktan sonra, dört kez yükleme tamponunun 20 mikrolitresinde 60 mikrolitre hücre lizat ve beş dakika boyunca 95 derecede ısıtın. Lizis tamponuna benzonaz ilavesi, hücre lizat viskozitesini azaltan nükleik asitleri hızla hidrolize eder.
Benzonazlı lysates viskoz değildir. Benzonazsız lysates, döndürdüğünde peletlemeyecek büyük bir yapışkan DNA küreye sahiptir. Histone proteinleri için beş ila 20 mikrogram toplam hücre lisatına ve gradyan dört ila 12 bis-tris protein jelinde diğer proteinler için 20 ila 100 mikrograma yükleyin.
Mops'taki jölenin etrafında, 100 voltta yaklaşık iki saat boyunca veya mavi yükleme boyası jelin dibine ulaşana kadar çevreleyen tampon olarak. Islak bir transfer gerçekleştirirseniz, transfer sandviçini buz gibi tris-glisin transfer tamponunda monte edin. PvDF membranımı, metanol ve denge jelini transfer tamponunda 30 saniye önceden bekleterek etkinleştirin.
Süngerleri filtre kağıdı, PVDF membran ve jelleri üreticinin talimatlarına göre yerleştirin. Proteinleri tris-glisine transfer tamponunda 70 voltta buz üzerinde bir ila bir buçuk saat aktarın. Transferden sonra, membranı bloke tamponunda 30 dakika kuluçkaya bırakın.
Yıkama tamponu ile durulayın ve dört derecede bir gecede birincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, membranları yıkama tamponu ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın, oda sıcaklığında 30 dakika floresan etiketli ikincil antikorlarla kuluçkaya yatır ve yıkama tamponu ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Membranı floresan Batı leke görüntüleyicinin cam plakasına yüzüstü yerleştirin.
Kauçuk tabaka ile örtün ve hava kabarcıklarını çıkarın. Sinyali 700 ve 800 nanometreden oku. Tarama yapıldıktan sonra, görüntüye gidin ve bantları net bir şekilde görmek için 700 ve 800 kanal sinyalini ayarlayın.
Burada kırmızı olarak gösterilen 700 kanal sinyali toplam protein seviyelerini, yeşil olarak gösterilen 800 kanal sinyali ise metillenmiş protein seviyelerini temsil eder. Ardından, analize gidin ve ortanca üst ve alt okumayı seçin. Bant yoğunluğunu ölçmek için, dikdörtgen çiz aracını seçin ve şekli ölçmek istediğiniz bantların etrafına çizin.
700 ve 800 kanallık yoğunlukları bulduğunuz şekillere gidin. Sinyal adı verilen sütun, arka plan çıkarılarak yoğunluk seviyeleri sağlar. Sonuçlar doğrudan Excel dosyasına kopyalanabilir.
Burada, PRMT tip 1 inhibitörü MS023 ile inhibisyon üzerine hücrelerdeki PRMT1 aktivitesinin analizini gösteren örnek verilmiştir. PRMT1 aktivitesi histone H4 arginin 3 asimetrik dimetilasyon düzeyleri belirlenerek ölçülür. Burada, metilasyon seviyeleri, yeşil bantlar doza bağlı bir şekilde düşerken, toplam histone seviyeleri kırmızı bantlar değişmeden kalır.
Bileşik IC50'yi belirlemek için inhibitör konsantrasyonunun logaritmasını, doğrusal olmayan uyum analizinin ardından toplam histone seviyelerine normalleştirilmiş histone H4 arginin-3 asimetrik dimetilasyon seviyelerine karşı çizin. Açıklanan yöntem, protein metiltransfenazın hücrelerdeki aktivitesinin sorumlu ve tekrarlanabilir bir çift tespitini sağlar. Yöntemin avantajı, akademik laboratuvarlar için erişilebilir olan ve laboratuvar ekipmanına bağlı olarak kolayca değiştirilebilen iyi bilinen Batı blotting metodolojisini kullanmasıdır.
Makalede, her bir PRMT aile üyesi için biyo-belirteç proteinleri, antikorlar ve kimyasal iki bileşik dahil olmak üzere test ayrıntıları verilmiştir.
