İskelet kası, nitrite dönüştürülmesinden sonra, egzersiz sırasında bir NO kaynağı olarak hizmet eden önemli bir nitrat rezervuarı görevi görür. Burada kas ve diğer dokulardaki bu iyonları ölçmek için metodoloji sunuyoruz. Başlamak için, 890 milimolar potasyum ferrisiyanür ve 118 milimolar n-metilmaleimid damıtılmış suda birleştirerek nitrat koruyucu veya durdurma çözeltisini hazırlayın, çözelti içinde kristal kalmamasını sağlayın, ardından 1-9 oranında iyonik olmayan bir yüzey aktif madde ekleyin ve köpüklenmeyi önlemek için hafifçe karıştırın.
Durdurma çözeltisini damıtılmış su ile 1'e 9 oranında seyreltin ve seyreltilmiş durdurma çözeltisini homojenizasyon tüpüne ekleyin. Daha sonra, önceki izole edilmiş ve donmuş sıçan kas dokusunu buz üzerinde çözün. Doku çözüldükten sonra, kalan yağ ve bağ dokusunu iskelet kasından çıkarın.
İskelet kasının parçalarını kesin ve kuruması için bir gazlı bez üzerinde lekeleyin. Uygun miktarda iskelet kası dokusunu tartın, ardından ağırlık öncesi dokuyu durdurma çözeltisini içeren homojenizasyon tüplerine yerleştirin. Döner homojenizatörde homojenizasyon için, önceden tartılmış iskelet kasını ve önceden ölçülmüş durdurma çözeltisini içeren M tipi tüpü makineye yerleştirin.
Her numuneyi iki kez homojenize edin ve her homojenizasyondan sonra, soğuması için tüpü hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Homojenizasyondan sonra, tüpü kısaca santrifüj edin. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve 15 saniye boyunca vortekslemeden önce uygun miktarda metanol ekleyin.
Numuneyi tekrar homojenize edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Boncuk homojenizasyonu için, iskelet kası dokusunu boncuk içeren bir tüpe yerleştirin ve cihazda bulunan en yüksek hızda 45 saniye boyunca iki kez homojenize edin. Her homojenizasyondan sonra, tüpü soğuması için hemen 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, ardından tüpü santrifüj edin, tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve vorteksten önce 15 saniye boyunca uygun miktarda metanol ekleyin.
Numuneyi 45 saniye boyunca bir kez daha homojenize edin, ardından 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin. Pulverizatör bazlı homojenizasyon için, seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren tüpler hazırlayın, ardından tüplerin ağırlığını tartın ve kaydedin.
Öğütücü aletini kuru buz üzerinde 30 dakika soğuttuktan sonra, sıvı azotla soğutulmuş cımbız kullanarak, önceden tartılmış doku örneğini pulverizatöre aktarın, ardından dokunun sıvı azot sıcaklığında olmasını sağlamak için az miktarda sıvı azot ekleyin. Sıvı azotun% 95'i buharlaştıktan sonra, kırma aletini dokunun üstüne yerleştirin ve numunenin ezildiğini hissetmek için sıkıca bastırın, ardından bir tokmak kullanarak kırma aletine 3 ila 5 kez vurun. Tüm numune toz haline getirildiğinde, sıvı azot soğutmalı bir kaşık ve cımbız kullanarak, ezilmiş dokuyu doğrudan seyreltilmiş durdurma çözeltisini içeren önceden tartılmış tüpe aktarın.
Ardından, tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin, ardından kapağa sıkışmış herhangi bir doku olup olmadığını kontrol etmek için tüpü açın. Varsa, yerinden çıkarmayı deneyin, sonra tekrar vorteks. Numuneyi 2 ila 3 saniye boyunca kısaca santrifüj edin.
Tüpü tekrar tartın ve orijinal tüp ağırlığını bu yeni ağırlıktan düşerek doku ağırlığını hesaplayın. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Tüpe uygun miktarda metanol ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe etmeden önce tüpü 15 saniye boyunca iyice vorteksleyin, ardından numuneyi santrifüj edin, süpernatanı aspire edin ve nitrit ve nitrat seviyelerini ölçmeye devam edin.
Döner homojenizatör, boncuk homojenizatörü ve öğütücü kullanılarak hazırlanan nitrat seviyeleri ve sıçan iskelet kası homojenatları benzerdi. İlginç bir şekilde, nitrit seviyeleri için, bir öğütücü tarafından hazırlanan homojenat numunesi, diğer iki numune değerinden istatistiksel olarak farklı olan en yüksek değeri gösterdi. Bir boncuk homojenizatörü kullanılarak 20, 50 ve 200 miligram dokudan hazırlanan gluteus homojenatlarındaki nitrit ve nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, ne nitrat ne de nitrit seviyelerinin kas numune boyutları arasında anlamlı derecede farklı olmadığını göstermiştir.
Farklı kemirgen bacak iskelet kas dokularındaki nitrat seviyelerinin karşılaştırılması, gluteus kasının diğer üç kas dokusundan yaklaşık iki kat daha yüksek nitrat seviyelerine sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bu farklılıklar istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. Nitrat seviyelerine benzer şekilde, gluteus kasındaki nitrat konsantrasyonu da diğer üç kas dokusundakinden daha yüksekti ve gastroknemius örneğindekinden anlamlı derecede yüksekti.
Yöntemimiz nispeten basittir ve numune hazırlama sırasında nitrat ve nitriti korurken küçük numuneler için çok uygundur.
