Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. SEM, makropinositik membran aktivitelerini görselleştirmek için kullanılabilecek hücre yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlar. Bu teknik, makropinositozu düzenleyen yeni sinyal yollarını keşfetmek ve yeni stimülatörleri ve mikropinositoz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılabilir.
Steril cam kapak kaymalarını, otoklavlanmış forseps kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirerek başlayın. Daha sonra tohum ham 264.7 makrofajları kapak üzerine mililitre başına 10 ila altıncı hücre yoğunluğunda kayar ve plakayı gece boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, her bir kuyucuktaki ortamı 500 mikrolitre taze tam ortam ile değiştirin, ardından makrofajlara DMSO gibi bir araç kontrolü veya EIPA gibi bir makropinositoz inhibitörü ile 30 dakika boyunca ön işlemden geçirin.
Daha sonra, membran karıştırmayı teşvik etmek için, hücreleri 30 dakika boyunca, bir mikromolar PMA çözeltisi veya mililitre makrofaj kolonisi uyarıcı faktörü başına 100 nanogram gibi makropinositoz uyarıcıları ile tedavi edin. Elektron mikroskobu taramak için hücreleri sabitlemek için, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve kapak fişlerini buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın, ardından kapak kaymalarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir fiksatif içinde inkübe edin ve ardından dört santigrat derecede gece inkübasyonu yapın. Ertesi gün, hücre tek katmanını rahatsız etmeden, yavaşça yıkayın ve daha sonra kapak kaymalarını 15 dakika boyunca 500 mikrolitre 0.1 motorlu sodyum kakodilat içinde inkübe edin.
500 mikrolitre damıtılmış su ile iki yıkamanın ardından, kapak kaymalarını 500 mikrolitre derecelendirilmiş etanol serisinde iki kez yıkayın, her yıkamada 10 dakikalık bir inkübasyon ile yıkayın. Kritik nokta kurutma işlemi gerçekleştirmek için, kapak kaymalarını kritik noktalı bir kurutucuya yerleştirin ve% 100 etanol ile örtün. Ardından, güç düğmesine basın ve karbondioksit tankını açın.
Sıcaklık sıfır santigrat dereceye düşene kadar soğutma düğmesine yaklaşık 30 saniye basın. Ardından, hazne penceresinde bir kabarcık görünene kadar doldur düğmesine basın. Ardından, temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar temizleme düğmesine basın.
Ardından, sıcaklık sıfır santigrat dereceye düşene kadar soğutma düğmesine tekrar basın. Kapatmak için tam ve temizle düğmelerine tekrar basın. Ardından, karbondioksit tankını kapatın.
Kapatmak için soğutma tabanına tekrar basın, ardından ısı düğmesine basın. Sıcaklığı 42 santigrat dereceye ve basıncı inç kare başına 1.200 pound'a ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendikten sonra, basıncın yavaşça düşmesine izin vermek için boşaltma düğmesine basın.
Oda basıncı inç kare başına 150 pound'a ulaştığında, havalandırma tabanına basın ve basınç inç kare başına sıfır pound'a düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve kapak kaymalarını çıkarın. Daha sonra, karbon yapışkan musluklar kullanarak, kapak kaymalarını elektron mikroskobu taramak için alüminyum numune yuvalarına monte edin, ardından bir püskürtme kaplayıcısında altın veya paladyum kullanarak püskürtme kaplamasına devam edin.
Püskürtme kaplayıcısının güç düğmesini açın. Vakum 30 militorra ulaştıktan sonra, gaz anahtarını kapatıp ince gaz valfini saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için odayı yıkayın. Vakum 200 militorr'a yükseldiğinde, gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 militorr'a ulaşana kadar bekleyin.
Ardından, gösterildiği gibi nemi ve havayı gidermek için odayı tekrar yıkayın. Odayı üç kez yıkadıktan sonra, zamanlayıcının altına bastırın ve gösterge 10 miliamper okuyana kadar voltaj düğmesini ayarlayın. Ardından, kaplanmış kapak kaymalarını odadan çıkarın.
Membran fırfırlarını görselleştirmek ve ölçmek için, numune kapağı fişlerini taramalı elektron mikroskobunun odasına yerleştirin, kapıyı kapatın ve evac düğmesine basın. Mikroskop işletim yazılımını açın ve hızlanma voltajını 15 kilovolta ve çalışma mesafesini 10 milimetreye ayarlayın. Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar kontrol cihazının etrafında hareket edin.
Büyütmeyi 3.500 X olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesini tıklatarak örneği görüntüleyin. Burada, PMA ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör ile tedaviyi takiben ham 264.7 makrofajlarda membran fırfırı oluşumunu gösteren temsili taramalı elektron mikroskobu görüntüleri gösterilmektedir. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu azaltır.
Fırfır oluşumu sırasında, plazma zarı, tabaka benzeri bir membran çıkıntısı, C şeklinde bir membran fırfırı ve bir makropinositik kap dahil olmak üzere farklı morfolojik aşamalardan geçer. PMA ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör tedavilerini takiben membran fırfırı oluşumu taramalı elektron mikroskobu kullanılarak ölçülebilirken, makropinozom oluşumu Texas kırmızı dekstran ve FM4-64 kullanılarak konfokal mikroskopi gibi alternatif görüntüleme teknikleri ile doğrulanabilir. Mavi oklar zarın karıştığını gösterirken, sarı ve yeşil oklar mikropinozomları işaret eder.
Son olarak, makropinositoz, FITC veya Texas kırmızı dekstran gibi bir floresan sıvı faz belirteci kullanılarak akış sitometrisi ile doğrulanabilir ve ölçülebilir. SEM'e ek olarak, makropinositozu araştırmak ve ölçmek için floresan etiketli dekstran içselleştirmesinin canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi analizi de yapılabilir.
