Videoda, mesane kanseri hücrelerinden kaynaklanan hücre dışı veziküllerin in vitro olarak dondurularak kırılması için bir protokol sunuyoruz. Hücre dışı veziküller, hücrelerden türetilen ve hücreler arası iletişimde rol oynayan membran sınırlı veziküllerdir. Hücre dışı veziküller içinde, kökenlerine, boyutlarına ve moleküler bileşimlerine göre farklılık gösteren üç popülasyonu, eksozomları, mikro-parçacıkları ve apoptotik cisimleri ayırt ediyoruz.
Hücre dışı veziküllerin moleküler bileşimi, donör hücrenin moleküler profilini yansıtır ve alıcı hücredeki biyolojik süreçlere müdahale eder. Bununla birlikte, hücresel veziküllerin sınırlayıcı zarının bileşimi, alıcı hücre zarı ile etkileşim için çok önemlidir. Sınırlayıcı membranın organizasyonunu analiz etmek için, hücre dışı veziküller önce izole edilmeli ve daha sonra donma-kırılma tekniğine yaklaşılmalıdır.
Donma kırığı, veziküller de dahil olmak üzere biyolojik membranların iki boyutlu organizasyonunu incelemeye adanmış bir elektron mikroskobik tekniğidir. Donma-kırma adımları, numunenin hızlı bir şekilde dondurulması, numunenin kırılması, dondurulmuş kırık yüzeyin replikasının yapılması ve biyolojik materyallerin çıkarılması için replikanın temizlenmesidir. Replikalar nihayet transmisyon elektron mikroskobu ile görselleştirilir.
Amacımız, mikro-parçacıkları şekil, boyut ve membran bileşimi açısından karakterize etmek için donma-kırılma tekniğini kullanmaktı. Hücre inkübatöründe büyüyen hücrelerle başlayın. Değişkenliklerini ve birleşimlerini doğrulamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin.
Kültür ortamını mikro-parçacıklarla tüplere toplayın ve 10 dakika boyunca 300 g kuvvetinde santrifüj yapın. Süper natant topla. Daha sonra, 2000 g-kuvvetlerinde ve 10.000 g-kuvvetlerinde süpernatant santrifüj.
Bundan sonra, mikro-parçacıkları gösteren beyazımsı bir pelet için tüpün ucunu gözlemleyin. Süper natantı dikkatlice çıkarın. 1,5 mililitre PBS ekleyin ve mikro-parçacıklar içeren peleti yeniden askıya alın.
Daha sonra 10.000 g-kuvvetinde santrifüj. Beyazımsı pelet için gözlemleyin. Süper natantı çıkarın ve yavaşça fiksatif ekleyin.
4 santigrat derecede 20 dakika bekletin. Daha sonra fiksatifi çıkarın ve peleti tekrar askıya almadan durulamak için yıkama tamponu ekleyin. 4 santigrat derecede 10 dakika bekletin.
Yıkama tamponunu çıkarın ve pelete% 30 gliserol ekleyin. Peleti homojen süspansiyona tekrar askıya alın ve 4 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Orta çukurlu temiz bakır taşıyıcılar hazırlayın ve kaşlarını çatma ve sıvı azotlu şişe geliştirin.
Mikroskop altında, numuneyi bakır taşıyıcının merkez çukuruna aktarın. Sıvılaşmak için katılaşmış freonu karıştırın. Taşıyıcının dış halkasını cımbızla tutun ve soğutulmuş freona batırın.
Sekiz saniye sonra taşıyıcıyı hızlı bir şekilde sıvı azotlu şişeye aktarın. Cryo'yu aşağılık olarak işaretleyin ve soğutun. Sıvı azot altında taşıyıcıları aşağının içine toplayın, kapatın ve donma kırılmasına kadar sıvı azot kabında saklayın.
Donma fraksiyon ünitesini üreticilerin kullanım talimatlarına göre hazırlayın. Vakum sistemini çalıştırın ve ünite haznesini eksi 150 santigrat dereceye kadar soğutun. Dondurulmuş numuneli bakır taşıyıcıları dondurarak kırma ünitesine aktarın.
Bıçak sıcaklığını eksi 100 santigrat dereceye ayarlayın ve vakumu bekleyin. Numunenin yüzeyi pürüzsüz olana kadar bıçağın motorlu hareketini açarak numuneyi bölümlere ayırmaya başlayın. Kırılma için bıçağın motorlu hareketini kapatın ve bıçağın yavaş manuel kontrolüne devam edin.
Platin gölgeleme ile 45 derecelik açıyla devam edin. Yüksek gerilimi açın ve akımı platin tabancaya yükseltin. Platin kıvılcımları numuneyi gölgelemeye başlamalıdır.
Kuvars kristal kalınlığındaki monitörde platinin konumunu denetleyin. Önerilen platin kalınlığı 2.5 nanometredir. Akımı ve yüksek gerilimi kapatın.
90 derecelik bir açıyla karbon gölgeleme işlemine devam edin. Yüksek gerilimi açın ve akımı karbon tabancasına yükseltin. Karbon kıvılcımları numuneyi gölgelemeye başlamalıdır.
2.5 nanometre karbon elde edildiğinde, akımı ve yüksek gerilimi kapatın. Bu numuneleri kopyalarla birlikte dondurarak kırılma ünitesinden çift damıtılmış suyla doldurulmuş 12 valfli bir plakaya aktarın. Taşıyıcılar batarken kopyalar su yüzeyinde yüzecektir.
Tel halkalı kopyaları sodyum hipoklorit ile doldurulmuş 12 valfli bir plakaya aktarın ve gece boyunca inkübe edin. Kopyaları çift damıtılmış suda yıkayın. Onları bir ağ bakır TM ızgarası üzerinde toplayın ve iki saat boyunca havada kurumasını bekleyin.
Kopyaları görüntülemek ve mikrograflar elde etmek için bir transmisyon elektron mikroskobu kullanın. Kopyaların ve mikrografların doğru yorumlanması için, terminolojide doğru oryantasyon için yönergeleri izleyin. Replikaların analizleri, izole edilmiş şartlandırılmış ortamın veziküllerin zenginleştirilmiş fraksiyonunu içerdiğini göstermiştir.
İzole veziküller ya üç ya da daha fazla küme halinde toplandı ya da çok ayrı ayrı dağıtıldı. Veziküller küresel olarak şekillendirilmiştir. Veziküllerin çapı, mikro-parçacıkların çapına karşılık geliyordu.
Donma-kırılma ayrıca mikro-parçacık membranının iki boyutlu organizasyonunu da ortaya çıkardı. Mikro-parçacıkların ekzoplazmik fazı pürüzsüz, homojen bir görünüme sahipken, protoplastlar fazında membranlar arası parçacıkları gözlemledik. Membranlar arası parçacıklar sporadik olarak ortaya çıktı, bu da kanser materyali hücrelerinden izole edilen mikro-parçacıkların sadece düşük miktarda membran proteini veya protein grubu içerdiği anlamına gelir.
Özetlemek gerekirse, sunulan protokolde kullanılan dondurucu-kırık tekniği, hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu için en uygun teknik olduğunu kanıtlamıştır ve diğer hücre dışı vezikül popülasyonlarının değerlendirilmesinde kullanılabilir. Dondurarak kırılma tekniğinin önemli bir avantajı, hücre dışı veziküllerin biyolojik fonksiyonunu belirleyen vezikülleri sınırlayan membranın iç organizasyonunu çözme gücüdür.
