Bu çalışma Wellcome güven hibe WT091939MA tarafından finanse edildi. Alain Filloux Royal Society tarafından desteklenmektedir.

1. Bakteriyel Suşlarının ve Kültürleri <ol><li> (Standart CaCI2 tedavi veya elektroporasyon kullanarak) 15 E. dönüştürerek bir Escherichia coli alıcı hücre (Prey, P) Mühendisi lacZ geni (Tablo 1) a-tümleme izin veren bir plasmid ile DH5α coli hücreleri. Levha Luria-Bertani agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreler (LBA,% 1.5 agar) ihtiva eden 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galactopyranoside (X-gal) 40 mg / ml nihai konsantrasyon ve uygun antibiyotik. ° C gecede ve ertesi sabah (§ 1.3) mavi transformantlar için seçin 37 inkübe edin. </li><li> T6SS-aktif Pseudomonas aeruginosa donör hücreleri büyümek (D +) veya T6SS-inaktif (D-) (Tablo 1) gecede LBA üzerine 37 ° C&#39;de Örneğimizde, bir P. ikinci Burada sunulan aeruginosa RETS sahip zorlanmayapısal olarak aktif bir H1-T6SS 16 ve H1-T6SS gen kümesinin (Tablo 1) ve bir silme ile bir izogenik mutant. </li><li> Ertesi gün, E. arasında parlak mavi klon inokülasyon ile gazlı balona bir gecede sıvı kültür hazırlamak plakadan coli Transformantlar, (P) uygun bir antibiyotik ilave triptik soya suyu (TSB) içinde 5 ml, § 1.1 &#39;de tanımlanmıştır. 37 ajitasyon altında büyümek ° C. § 1.2 &#39;de tarif edilen plaka - (D) (D +) ve tek bir koloni ile aynı şekilde devam edin. </li></ol> 2. Rekabet Testi <ol><li> Bir sonraki gün plakalar deney için LBA hazırlayın. Bu levhaların düzgün (Bunsen beki yakın veya laminar flow kabin ya) kurutulur emin olun. (D -) suşları (D +), bir &quot;Assay-girdi&quot; (A-Girişi) plaka hazırlayın ve (P </strong&gt;). Bir &quot;Assay-çıkış&quot; (A-çıkışı) suşlarında plakası hazırlayın (D - + P) ve (D + + P). Bölme ve buna bağlı olarak levhalar etiket. </li><li> Gecede büyüme sonra (§ 1.3), girişi bakteri kültürü (D - D + ve P) ve optik yoğunluk (OD 600Nm) ölçmek ve her bir suş 1 birim OD 600Nm bir hücre yoğunluğu eşdeğeri elde etmek için gerekli hacim hesaplamak . Her bir &quot;giriş&quot; hücre kültürü (D - D + ve P) başlangıçta steril 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüplerine alınır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 rpm&#39;de santrifüjlenir bakteri örnekleri ve süpernatan atılır. </li><li> D pelet yeniden süspanse edin -, D + ve P yumuşak pipetleme tarafından taze TSB 100 ul kültürleri ve her korelas 10 ml inoküle&quot;A-girdi&quot; plaka (§ 2.1 hazırlanmıştır) tek bir nokta olarak gerilme frekansı arayarak. </li><li> &quot;A-çıkış&quot; plaka (§ 2.1 &#39;de hazırlanmış) inoküle. Daha doğrusu, 30 ul (P) ve 30 ul ile (D +) ve yavaşça 30 ul karıştırın (D -) iki ayrı Eppendorf tüpleri (kullanılan kültürler § 2.4 &#39;te açıklanan olanlardır unutmayın) 30 ml (P) . Karışımları (D + / P) 20 ul inoküle ve (D - / P) &quot;A-çıkış&quot; plaka üzerinde tek tek noktalar gibi. Noktalar Yakın bir Bunsen beki kuru ve bakteri öldürme gerçekleşiyor sırasında zaman uygun bir süre için 37 ° C&#39;de bir inkübatör plaka yerleştirmek için izin ver. P. halinde aeruginosa, etkin bir bakteri öldürme 5 saat inkübasyon sonrasında T6SS kusurlu zorlanma ile aktif bir T6SS karşılaştırırken görülmektedir. </li></ol> 3. T Nitel GözlemO Bakteriyel Öldürme <ol><li> 40 ug / ml testin okuması için X-gal içeren LBA tabak hazırlayın. Plakaları &quot;Okuma girişi&quot; veya izole bakteri veya &quot;Okuma çıkış&quot; veya &quot;R-çıkış&quot; karışık bakteri kültürleri nokta ve böylece öldürme performans okumak için nokta &quot;R-girdi&quot; adı verilecek. Bu plakalar düzgün kurulanmalıdır da gerekir. Sırtında dört eşit parçaya plaka bölün ve 0, 10 -1, 10 -2 10 -3 bu parçalar açıklama, (§ 3.3) agar plaklarına nokta bakteriyel kültür dilüsyonları tayin. Seyreltme aynı nokta içinde mavi / beyaz bakteri oranı yarı-kantitatif değerlendirme sağlayacaktır. </li><li> &quot;A-girişi&quot; plaka (§ 2.4 bakınız) steril bir döngü bireysel bakteriyel noktalar ve &quot;A-çıkış&quot; plaka (§ 2.5) ile toplayın ve TSB 1 ml içeren ayrı ayrı 1.5 ml Eppendorf tüpleri her yerinde tekrar süspansiyon haline getirin. Verimli bir şekilde tekrar süspansiyon 30 dakika boyunca bir Eppendorf çalkalayıcı blok yerleştirinbakteriler. </li><li> TSB 900 ul içeren 5 kez 3 Eppendorf tüpler bir dizi hazırlayın ve 10 -3 ila on kat seri dilüsyonları kadar her yeniden süspanse nokta için devam edin. Pipet uçları değiştirmek ve her seyreltme adım arasında girdap 5 saniye için emin olun. </li><li> , Sulandırılmamış süspansiyon en seyreltilmiş başlayarak 40 mikrogram / ml X-gal içeren iyi kurutulmuş LBA plakaları § 3.3 &#39;de hazırladığınız bakteriyel dilüsyonlarının lekelenme &quot;A bu&quot; R-girdi &quot;plakaları yapmaya devam edin -girdi &quot;lekeleri ve&quot; A-çıkış &quot;noktalar (Şekil 2) R-çıkış&quot; için plakaları &quot;. Homojen bir bakteri süspansiyonu tutmak lekelenme geçmeden önce kısaca Vorteks her tüp. Bir çeyrek içinde sonuçları, üç nüsha spot 20 ul (Şekil 2) tekrarlanabilirlik için. Noktalar tek tek plaka üzerinde ayrı kalır ve birbirlerine karşı kayma değil gerekir çünkü plaka göreli kuruluk bu aşamada önemlidir. Rekabet tahlil bir miktarının deney, bu aşamada da mümkündür. Adım 3.3 takiben, 40 mg / ml X-gal içeren LBA plakalar üzerinde seyreltme 10 -3 100 ul yayıldı. Sonuçların tekrarlanabilirliği için, &quot;A-çıkış&quot; plağı üzerindeki her nokta için üç nüsha halinde bir kaplama geçin. ° C inkübatör gece boyunca (16 saat inkübasyon karşı gelen) bir 37 sulandırma tabakları yerleştirin. Mavi koloniler (canlı kalmıştır P hücreleri) sayma işlemine geçin. Rekabet 5 saat sonra elde edilen Tipik sonuçlar, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Her bir nokta içinde fazla sıvı emme izin vermek için, steril bir bölge içinde plaka açık (hiçbir kapak) bırakın. </li><li> Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör içinde plaka yerleştirin. Bu inkübasyon süresi boyunca, öldürülmesi hala iki suşları hala temasta olduğundan (D + / P) karışımı gerçekleşiyor. </li><li> Fotoğraf çekmekya çıktı analizi (Şekil 2) için plakalar tarayın. Lekeler çoğunlukla mavi kalır Nerede gösterir E. coli P. tarafından öldürüldü olmamıştır aeruginosa. Bu durum böyle olduğunda, E. coli bir T6SS kusurlu P. ile karıştırılır aeruginosa suşu (D-) (Şekil 2, sağ alt plakası). </li></ol>

<ol>
	<li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+type+VI+secretion+machine:+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes.">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570 (2008).</li><li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems.">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102 (2012).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers.">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355 (2010).</li><li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block.">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733 (2008).</li><li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin.">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154 (2009).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin.">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508 (2007).</li><li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells.">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234 (2009).</li><li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria.">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25 (2010).</li><li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells.">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein.">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613 (2012).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae.">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li><li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions.">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876 (2010).</li><li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors.">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057 (2011).</li><li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis:+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources?.">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?.</a> BMC Genomics. 10, 104 (2009).</li><li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A Laboratory Manual. , (1982).</li><li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus.">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526 (2006).</li><li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+VI+secretion+system:+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery.">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751 (2011).</li><li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa:+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins.">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317 (2011).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu makalede sunulan yöntem T6SS-aracılı bakterisidal / bacteriostasis eylemin görsel gözlem sağlar. Tahlil bir agar plaka yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce karışık sıvı bakteri kültürü ile gerçekleştirilir T6SS-bağlı öldürme deneyi çünkü iki bakteri 8 arasında sürekli temas olmaması nedeniyle olası, etkili olmadığı gösterilmiştir. T6SS hedef hücreler 17 içine DNA enjekte etmek için bakteriyofaj tarafından kullanılan ile benzer bir mekanizma ile çalışır inanılmaktadır. Sıvı kültüründe T6SS ve tüp benzeri yapı daha kolay kırılabilir, inter-bakteriyel temas kaybetmiş olabilir ve toksinler verimli teslim edilmez. Inkübasyon sürelerinde açısından, biz donör zorlanma ve avını arasındaki açıklayan temas 5 başlangıç ​​saatleri P. arasındaki bakteri öldürme gözlemlemek yeterlidir aeruginosa, E. Şekil 3 &#39;de gösterildiği coli </strong&gt;. Bununla birlikte, bu deney koşulları optimize etmek için bir kinetik gerçekleştirilerek kuluçka zamanı ayarlamak için tavsiye edilir. Bu yöntem, bir renk dayalı bir teknik olduğu için, çıkış sonuçları verici suşu pigmentasyon ile kısıtlanabilir. Örneğin, S. durumunda aeruginosa, bazı suşlar av gelen ayrım nispeten zor yapma, tahlil okuma engelleyebilir gibi pyocyanin ve pyoverdine gibi renkli pigmentler yüksek düzeyde üretmek. Böyle eflatun-gal veya kırmızı gal gibi diğer kromojenik β-galaktosidaz substratlar, X-gal (Tablo 1) yerine kullanılabilir. Yarışma testi okuma için diğer muhabiri genleri yararlanabilirler. Örneğin, benzer bir deneyi de yeşil floresan protein etiketli avlayan 12 kullanılarak yapılmıştır. Bizim tayini, nicel olmasa da, iyi bir fikir veriyorT6SS faaliyetin bu hayatta kalma ya da bir muhabir yırtıcı öldürülmesi dayalı olduğu. Bu teknik, basit ve herhangi bir bakteri türlerinin T6SSs bakterisidal / bacteriostasis aktivitesini değerlendirmek için uygun olma avantajını sağlar. Şimdiye kadar, T6SS faaliyeti Gram-negatif bakteri ve T6SS-duyarlı Gram-pozitif bakterilere ait herhangi bir karşı örneği gösterilmiştir 12 henüz rapor edilmiştir. Bu test etmek için çeşitli bakteri türleri üzerinde kültür uyumsuzluk (örneğin, büyüme sıcaklık, oksijen, belirli bir ortam) dikkate alınmalıdır olduğu da açıktır. Tüm tahlil bir salgılanan toksin bile izleri av öldürmek için yeterli olabilir çünkü T6SS bileşenleri olan kesinlikle gereklidir değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültür süpernatant ve western blot kullanarak standart bir prosedür testi T6SS bağımlı sekresyonunu göre T6SS bile zayıf aktivite sonra açıkça bizim tahlili ile tespit edilebiliranalizi. Bununla birlikte, uygun bir koloni oluşturan birim (CFU) sayım yine bu T6SS aktivitenin tayini için daha kesin gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETS (D +) (Aktif T6SS) </td><td> Lab gerginlik </td><td></td><td> Referans 16 Açıklandığı </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETS Δ H1-T6SS (D -) (inaktif T6SS) </td><td> Bu çalışma, </td><td></td><td> H1-T6SS küme (genler PA0070 için PA0095 kapsayan) Başvuru 18 bölümünde açıklanan yordamı izleyerek allelik döviz tarafından silindi. Up parçası primerleri: mutator fragmanı primerlerin aşağıdaki seti ile oluşturulan: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, ve 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Aşağı parçası astarlar: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 sonunda A1 HSD R17 (r k - m k +) pho bir sup ​​E44 λ-thi -1 Gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Bu vektör, α-tümleme için kullanılan β-galaktosidaz α peptid ifade eder. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> 40 mikrogram / ml &#39;de kullanın </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck kimyasalları </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (kazein soya broth) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex çalkalayıcı Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Tarayıcı </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Hücre Yoğunluk Ölçer </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı-gal </td><td> Araştırma organikler </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Kullanılan Strain plazmid, malzeme ve reaktif. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

Tip VI salgılama sistemleri (T6SSs) Gram-negatif bakteriler hedef hücrelerin 1,2 içine çeşitli proteinlerin taşınması ve enjekte izin veren moleküler nanomakineler vardır. T6SS 13 temel bileşenden oluşur ve bakteriyofajlar 3 kuyruk tüp ile yapısal benzerlikler sergilemektedir. Faj bir tüp ve hedef bakterilerin hücre zarfı nüfuz ve DNA enjekte etmek için bir delici aleti kullanır. Bu T6SS yüzeye etkileyiciler ve toksinler sürücü bakteriyel hücre zarf içinde belirli bir yol oluşturarak ters bakteriyofaj cihaz önerilmiştir. Bu süreç ayrıca alınabilir ve T6SS cihaz böylece bu hedeflerin içine enjekte etkileyiciler, bakteri temas halinde olan diğer hücreler ile delebilir olabilir. Kuyruk tüp ve T6SS ve delme cihazı parçaları sırasıyla 4,5, Hcp ve VgrG proteinler ile yapılır. T6SS çok yönlülüğü ler ile kanıtlanmıştırçeşitli bakteriyel patojenler kullanarak tudies. Vibrio cholerae T6SS bir C-terminal aktin çapraz-bağlayıcı etki 6,7 taşıyan bir &quot;gelişmiş&quot; VgrG enjekte ökaryotik konak hücrelerin, hücre iskeleti şeklini olabilir. Bir başka çarpıcı örnek son zamanlarda bu nedenle spesifik mikrobiyal nişler ve rekabetçi bir ortamda 8,9,10 bakteri kurulması teşvik, bir T6SS-bağımlı bir şekilde bakterileri hedef ve öldürmek mümkün Pseudomonas aeruginosa ile belgelenmiştir. İkinci durumda, yani üç T6SS-salgılanan proteinler, Tse1, Tse2 ve Tse3 hedef bakteri (Şekil 1) enjekte toksinler gibi tespit edilmiştir. Donör hücre Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 bağışıklık proteinleri 8,9,10 aracılığı ile bir anti-toksin mekanizması yoluyla bu efektörlerinin zararlı etkisi korunmaktadır. T6SS-yetkin bakteriler s co-yetiştirilmektedir Bu antimikrobiyal aktivite izlenebilirDiğer bakteri türleri ile veya aynı türün 8,11,12,13 arasında T6SS-inaktif bakteri ile rekabet içinde Olid yüzeyler. Mevcut veriler antibiyotik üreticileri büyük ölçüde bağlıdır zaman alıcı CFU sayma dahil, bakteriyel rekabet tahlil için sayısal bir yaklaşım geliştirilebileceğini vurguladı. P. gibi bir antibiyotiğe dirençli suşların halinde aeruginosa, bu yöntemlerin uygun olabilir. Ayrıca, 100&#39;den fazla bakteriyel genom 14 yaklaşık 200 farklı T6SS loci kimlik ile, uygun bir tarama aracı son derece arzu edilen bir durumdur. Biz kullanımı kolaydır ve standart laboratuar malzeme ve reaktifler gerektirir bir test geliştirdi. Yöntem lacZ geninin bir tümleme-izin veren bir yem (Bu durumda, Escherichia coli DH5α) gibi bir raportör suşu kullanılarak T6SS-bağımlı bakteri öldürücü / bacteriostasis aktivitesini izlemek için bir hızlı ve nicel teknik sunmaktadır. Genel olarak, bu yöntem bir grapHIC ve agar plaklarına T6SS ilgili fenotipleri hızla tanınmasına olanak sağlar. Bu deneysel protokol dikkate bu gibi büyüme ortamı, sıcaklık ya da temas süresi olarak belirli koşullar alma diğer bakteriler ya da bakteri türleri için adapte edilebilir.

Tipik sonuçlar Tablo 1 &#39;de tarif edilen suş ve reaktifleri ile Şekil 1&#39; de gösterilmiştir. Bu şekilde gösterilen plakaları bir gece boyunca inkübasyondan sonra tarandı. &quot;Okuma-Input&quot; plakaları bu deneyde kullanılan suşlar için bir seri seyreltme desen göstermektedir. Beklendiği gibi, E. coli ise donör P., eksprese lacZ geni X-gal ile takviye medya üzerinde mavi görünür lekeler (P) av aeruginosa suşları (D +, T6SS aktif) ve (D - T6SS inaktif) beyaz kalır. Av ve T6SS aktif gerinim (D + / P) arasındaki karışımı mavi kaybolması göstermek tespit edilmiştir hangi &quot;Okuma-çıkış&quot; plakalar böylece öldürüldüğünü gösteren av. Bu av outcompete için vericinin becerisini göstermektedir. (Üzerinde mavi renk kalıcılığıD - / P) plaka mavi avlarını öldürmek için bir inaktif T6SS donör yetersizlik göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. E. Öldürme T6SS-yetkin P. coli aeruginosa. P. aeruginosa E. içine toksinler enjekte bir T6SS bağımlı bir şekilde coli hedef hücreye (beyaz ok ile gösterilmiştir). İki toksinler Tse1 ve Tse3 (turuncu ve kırmızı daireler) E. içine enjekte edilir coli periplazmaya ve peptidoglikan 9 aşağılamak. Tse2 toksin (sarı daire) E. enjekte edilir coli sitoplazma ve bakteriyostatik aktivite 8,10 sahiptir. Toksinlerin kombine eylem hedef hücreler (yıldırım ve kafatası flaş) öldürür. Hedef hücrelerin hayatta kalma (Şekil 2 de bakınız) üretilmiş β-galaktosidaz faaliyeti takip edilerek tespit edilebilir. S. Bireruginosa bağışıklık proteinleri Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 (sırasıyla turuncu, sarı ve kırmızı kareler) 8,9,10 tarafından toksinlerin etkinliğe karşı korunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Agar plaka deneyinde T6SS-bağımlı bakteri öldürme izlemek için bu resimde üst kısmı D seri dilüsyonları oluşan &quot;Okuma-Input&quot; plakalar üzerinde gösterilir -., D + ve P giriş hücreleri. P giriş hücreler lacZ geninin α-tümleme dolayı mavi ve bu şekilde üretilen β-galaktosidaz keser ki X-gal. Alt kısımda, bir aktif (D + / P) arasında bakteri karışımı seri dilüsyonları oluşan &quot;Okuma-çıkış&quot; levha gösterilir </strong&gt; veya inaktif (D - / P), T6SS donör P. E. ile aeruginosa suşu coli avlarlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. E. öldürülmesi Niceleme P. coli 5 saat inkübasyondan sonra aeruginosa. grafiği E. CFU sayımı sunar coli 3.4 adımda anlatılan. Sonuçları öldürme en teması 5 ilk saatlerde gerçekleşiyor düşündüren, T6SS + ve T6SS-suşları arasında 3 kat fark gösterir Burada sunulan.

Watch this Scientific Journal Video about A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition at JoVE.com

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir tarif<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Tip VI salgı sistemi (T6SS). Deneyi taşıyan Escherichia coli hedef hücrelerin hayatta kalma / öldürme dayanır<em&gt; LacZ</em&gt;-Muhabiri. Bu teknik T6SS-yetkin mikroorganizmaların bakterisidal / bacteriostasis aktiviteyi değerlendirmek için ayarlanabilir.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Görüntüleme.  Imperial College London. Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir tarif Pseudomonas aeruginosa Tip VI salgı sistemi (T6SS). Deneyi taşıyan Escherichia coli hedef hücrelerin hayatta kalma / öldürme dayanır LacZ-Muhabiri. Bu teknik T6SS-yetkin mikroorganizmaların bakterisidal / bacteriostasis aktiviteyi değerlendirmek için ayarlanabilir.

Video: A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Sığırlarda Efektör ve hafıza T Hücre Yanıtları değerlendirilmesi için uzun vadeli kültürlü İnterferon-γ Enzim-linked immünospot Testi Uygulaması

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Bakteriyel Spor Filizlenmesinin sırasında Cortex Fragments algılama

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Streptomyces gelişimsel mutantlar görsel ve mikroskobik değerlendirilmesi

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Methods Article

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay