Yapışan hücreler çevrelerine kuvvet uygularlar ve bu kuvvetler, hücrelerin burada yeşil renkte gösterilen alt tabakaya uyguladıkları kuvvetleri ve hücrelerin komşularına uyguladığı kuvvetleri kırmızı renkte gösterir. Bu kuvvetler hücresel monolayerlerde monolayer stres mikroskopisi adı verilen bir teknik kullanılarak ölçülebilir. Kısaca, teknik, üst yüzeyin hemen altında küçük floresan boncuklar içeren hidrojellerin ve cama yapıştırılan büyük floresan boncukların hazırlanmasını içerir.
Bu hidrojel üzerinde, kişi hücreleri görür ve onları bir araya getirmek için kültürler ya da kuvvetleri ölçmek için arzulanan durum. Kuvvetlerin ölçümü, hücresel monolayerin görüntülenmesini, hücrelerin iletilen ışık görüntülerinin ve küçük ve büyük boncukların floresan ışık görüntülerinin yapılmasını gerektirir. Bu görüntülerin her biri aynı ses düzleminde elde edilir.
Bu görüntüler, hücreler hidrojelden bağlanıp ayrıldığında elde edilir. Ve bu iki görüntü kümesinin karşılaştırılması bize tüm bu güçleri ölçmek için gerekli verileri sağlar. İşte bu noktada AcTrM ve AnViM devreye giriyor.
Hücreleri plakalayıp, görüntüleri aynı konumda, istediğiniz herhangi bir örnekte elde etmek için, bu protokol AcTrM'ye programlanır ve daha sonra bu verileri analiz etmek ve sonuçları görselleştirmek için AnViM'in amacı budur. Önümüzdeki birkaç dakika içinde, bir izdiham hücresi monolayer için görüntü edinme sürecinde size yol gösterecektir. Eylem adım sıfır kullanıcıdan alım türünü seçmesini ister.
Yeni bir deney başlatmak için yeni bir satın alma veya daha önceki bir deneye devam etmek için sürekli bir satın alma. Pozisyon listesi oluşturmak için Yeni Edinme'yi tıklatın. Birinci eylem adımı, sonraki adımınızın tümlerini listeler.
Ve bu işlemler buradaki sahne pozisyonu listesi penceresinde yapılacaktır. Örneği el ile ayarlamalar için görselleştirmek üzere Mikro Yönetici'de Canlı'yı tıklatın. Canlı görüntüde, aşamaya bakacağız.
Burası çok açık. Şimdi, boncuklara bakmak gerekecek. Burada boncuklar floresan olarak görselleştirilebilir.
Bu yüzden üst boncuklar için uygun kanalı seçin. Birkaç alt boncuk görebilmeniz de önemlidir, bu yüzden alt boncuklar için bir kanala bakalım. Burada gördüğünüz şey alt boncukların bulanık bir görüntüsüdür ve bu görüntüde gördüğünüz gibi, alt boncukların orada olduğunu söyleyebilirsiniz.
Konum listesi, İşaretle'yi tıklatın. Pozisyon listesini bu şekilde oluşturursunuz. Önceki videoda açıklanan bir pozisyon listesi oluşturduktan sonra, çok boyutlu edinme penceresini kullanarak ikinci adımda listelenen adımları izleyin.
Diyelim ki uzun bir zaman atlamalı performans sergilemek istiyoruz. Burada, çekmek istediğimiz görüntü sayısını belirteceğim. İlk kanal faz kanalı olacak.
Bir sonraki en üst boncuklardan olacak ve ondan sonraki de alt boncuklar olacak. Çok boyutlu edinme penceresinde kapat'ı tıklatın ve AcTrM ikinci adımda Tamam'ı tıklatın. Çıktı, çok boyutlu alma penceresinde tanımlanan dizine kaydedilir.
Üçüncü eylem, denemenin kurtarılması gerekip gerekmeyeceğini soracaktır. Cevap genellikle evet olacaktır. Burada iTACS soruyor, rafine bir kurtarma gerçekleştirmek istiyor muyuz?
Bu ilk bölüm bizi rafine bir iyileşmeye oldukça yaklaştırır, ancak alt kısım bizi daha yüksek bir yeniden konumlandırma doğruluğuna daha da yaklaştırır. Kurtarma sınırlı bir görüş alanı kullanılarak yapılacaksa, bu seçenek sunulur, ancak bu deneme için bu seçeneği seçmeyeceğiz. Bu noktada, bir dizi referans görüntüsü elde edilmesi tamamlanır ve Micro-Manager kapatılabilir.
Görüntü alımı için AcTrM başlayacaktır. Büyütmeyi seçin ve veri klasörlerini içeren dizini seçin. Plakayı yeniden konumlandırmak için kullanılan kanalla birlikte seçenekleri belirleyin.
Şu anda kamerada görülenleri kaydedilen görüntülerle eşleştirmek için bir arayüz sağlanır. Çakışma varsa, görüntüler siyahla birlikte kırmızı ve yeşil bir renk görüntüler ve manuel ayarlama yapılabilir. Aksi takdirde, kabul et tuşuna bas ve edinme devam eder.
Artık FIJI'yi başlatabiliriz. MSM açılır menüsünde ön işleme etiketli ilk seçeneği belirleyin. Ardından, tnimgs klasörünü içeren klasörü seçin.
Daha sonra, hangi kanalın hangi görüntüye karşılık geldiğini tanımlamamız gerekecek. Bu örnekte, Kanal 0, hücrelerin faz kontrast görüntüsü olan iletilen ışık görüntüsüdür. Alt boncuk görüntüsü Kanal 2, üst boncuk görüntüsü ise Kanal 1'dir.
Ve sonra, size hücrelerin nereden geçtiğini ve görüntünün hangi tarafını sorduğunuzdur. Bu durumda, hücreler sağ kenara doğru ilerleyen bir monolayerdir, bu yüzden Sağ'ın seçimini kaldıracağız ve devam edeceğiz. Burada, monolayerden uzakta bulunan üst boncukların küçük bir bölgesi, burada gösterilenlerden daha seyrek ve daha büyük görünecek alt boncuk görüntüleriyle aynı amaca hizmet eder.
Şimdi bize boncukların belirgin bir şekilde görünmesi için parlaklığı ve kontrastı değiştirmek isteyip istemediğimizi soruyor. Bu nedenle, menüdeki kaydırıcı çubuklarını kullanarak ayarlıyoruz ve boncuklar belirgin göründüğünde Tamam'ı tıklayın. Ve şimdi, pozisyon düzeltme yapacağız. Herhangi bir kayma olursa, ondan kurtulacaktır.
Ve yapıldıktan sonra, analiz klasörünü oluşturacaktır. Analiz klasörünün içinde, konum klasörünü oluşturacak, P0 ve önceki ön işleme menülerinde yaptığımız seçimler, hangi kenarların çaprazlandığı, piksel boyutu ve hangi görüntünün faz kontrastı olduğu ve diğerleri gibi analiz seçimlerinde saklanır. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde MSM jel deformasyonu'nun öğesini seçin.
Buradan boncuk dağıtımımıza uygun seçeneği seçeceğiz. Ve veriler işlendikçe, konum klasöründe yeni bir yer değiştirme klasörünün göründüğünü görebilirsiniz. Burası tüm çıktı dosyalarının depolanacağı yer olacaktır.
Bu, analizin tamamlandığını gösterir. Hücre-ECM kavşağı ve hücre-hücre birleşimleri boyunca uygulanan kuvvetlerin ve ayrıca monolayerin tek tek hücrelerinin sitoskeletonunun nasıl hesaplanacağına bakacağız. Bunun için üçüncü seçeneği belirleyin.
Ve biri tnimgs ve analiz klasörünü içeren dizini seçecek, bu da bu dizinlerden herhangi biri yerine örnek dizini seçeceği anlamına geliyor. Seç tuşuna bastığınızda, size bu jelin kesme modülü nedir? Kesme modülü 1250 ve bu örnekteki hidrojel kalınlığı 118 mikrondur.
Beklenen gürültü seviyesi burada sağlanmaktadır. Daha sonra, bu durumda denetlenmeyen, yer değiştirme sıfır bayrağıdır. Tamam'ı seçin ve çekişi hesaplayan uygulama, AnViM'in bu sürümünde nasıl uygulandığını gösteren bir MATLAB işlevi aracılığıyla yürütülür.
Şimdi hücre-hücre veya sitoskeletal kuvvetler için hesaplama yapmaya hazırdır. Ve sorulması gereken ilk soru, monolayer bir arada mı? Bu özel durumda, ilerleyen bir monolayerimiz var ve çerçevenin sağ tarafında hücre bölgesi yok.
Yani cevap, monolayer'ın bir arada olmadığıdır, bu yüzden hayır diyeceğiz. Şimdi en büyük hücre dışı nesnenin etrafına bir çokgen çizmemiz isteniyor. Segmentasyon için uygun yöntemleri seçiyoruz.
Burada üç ve dördüncü yöntemlerde hücrelerin rengini belirtmemizi istiyor, bu yüzden burada hücreler siyah, bu yüzden siyahı seçeceğiz. Bu farklı yöntemlerden üretilen segmentasyon, hücre monolayerinde bazı delikler ve hücre olmayan bölgede bazı beyaz bölgelerle sona erer. Burada seçebilir, noktaları otomatik olarak doldurabilir ve OK.So vurabiliriz, şimdi tüm noktalar monolayerde doldurulur ve hücre alanı yoktur.
Ve sonra, hücresel monolayerdeki mekanik gerilimleri hesaplayacağız. Hücreleri hücresiz bölgeden ayırdığımız birinci bölümü zaten gerçekleştirdik, bu yüzden bu adıma tek tek hücrelerin ve görüntülerin segmentasyonu olan ikinci bölümle başlıyoruz. Biri tek tek hücreler için segmentasyon seçecek.
Ve burada bizden pozisyon dizinini seçmemizi istiyor. Ve bu parametreler için burada daha fazla bilgi verilmiştir. Daha sonra en küçük normal hücrenin etrafına bir çokgen çizmenizi ister.
Yani buraya çizdiğiniz şey alanı hesaplamak için kullanılır ve bundan daha küçük bir şeyin hücre olarak tanımlanmamasını şart koşardı. Ve sonra en büyük hücreyi istiyor. Sonra en büyük normal hücrenin etrafına bir poligon çiziyoruz ve sonra soruyor, hangisi daha parlak?
Hücre hücresi arabirimi daha mı parlak yoksa hücre merkezleri daha mı parlak? Bu durumda, hücre-hücre arayüzü daha parlak, bu yüzden hücre-hücre arayüzünü seçeceğim. Yani bu hesaplamanın tamamlandığını gösterir.
Hücre yoğunluklarında haritayı seçerek başlayalım. İlk olarak, iTACS kullanıcıdan P0 klasörü olarak da bilinen konum dizinini seçmesini ister. İşiniz bittiğinde Seç'i tıklatın.
Daha sonra kullanıcıya iTACS'in hücre bölünmesini algılamasını veya hücresel floresan miktarını ölçmesini isteyip istemediği sorulur. Bu durumda, hücre içinde floresan proteinimiz yok, bu yüzden hücre bölünmesini tespit etmeyi seçeceğiz. Bir sonraki slayt, kullanıcının komşu bölgenin boyutunu tanımlamasını sağlar, bu, AnViM'in tek tek hücrelerin özelliklerine ve komşu bölgenin özelliklerine baktığında gerçekleştirdiği benzersiz bir analizdir.
Burada, kullanıcı komşu bölgeye sahip bir hücrenin genişliğini seçebilir. Bu durumda, komşu bölgeleri 60 piksel ile tanımlıyoruz. İlk onay kutusu, iTACS'in hücrelerin özelliklerini toplamasını isteyip istemediğimizi sorar, evet iste, ve bu onay kutusu iTACS'in komşuların özelliklerini toplamasını isteyip istemediğimizi sorar, evet, iTACS'in de bunu yapmasını istiyoruz.
Bu onay kutularının altında, kullanıcı her onay kutusu hakkında daha fazla ayrıntı istiyorsa, iTACS onay kutuları hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu, analizin tamamlandığını gösterir. Yine, iTACS kullanıcıdan konum dizinini seçmesini ister.
Daha sonra, kullanıcıya kuvvet verilerini eşleme, kuvvet verilerinin görüntülerini oluşturma, hız verilerini eşleme ve hız verilerinin görüntülerini oluşturma seçeneği verilir. Görüntü oluşturmanın zaman aldığını unutmayın, bu nedenle şimdi yapmayı seçebilir veya daha sonra yapmayı bekleyebilirsiniz. Bu nedenle kullanıcıya seçenekleri seçme veya seçmeme seçeneği sunular.
Burada, iTACS kullanıcıdan komşu bölgenin boyutunu yeniden belirlemesini ister ve bizim durumumuzda 60 piksel olan yoğunlukları eşlemek için belirlediğiniz boyutu kullanabilirsiniz. Ve yine, kullanıcıdan hücrelerin ve komşu bölgesinin özelliklerini toplaması istenir. Bu, analizin tamamlandığını gösterir.
Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde, sonuçları izleme verilerini seçin. İlk olarak, iTACS kullanıcıdan P0 klasörü olarak da bilinen konum dizinini seçmesini ister. İşiniz bittiğinde Seç'i tıklatın.
Burada, iTACS, kullanıcının iTACS'in verileri izlemeye hangi kare numarasından başlamasını istediğini sorar. İki numaralı kareden izlemeye başlamak oldukça güvenlidir, çünkü hız bir numaralı kare için belirlenemez. Burada, iTACS kullanıcıdan aynı anda doldurulacak maksimum çizim sayısını belirtini ister.
Ve esasen, bu veri izlemeyi hızlandırmanın bir yoludur. İşiniz bittiğinde Tamam'ı tıklatın ve izleme sırasında değişkenleri seçme seçenekleri, ısı haritaları oluşturma seçeneklerine benzer şekilde sunulur. Ortak ilgi çekici özellikler pencerenin üst kısmındaki metin kutusunda sağlanır.
Ancak değişkenlerinizi özelleştirmek istiyorsanız, metin kutusundaki her şeyi silmeniz ve aşağıda listelenen belirli özellikleri seçmeniz yeterlidir. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde sonuç grafiğini seçin. Bundan sonra, iTACS kullanıcıya kullanıcının çizimi kırılmamış iz olan hücrelerle sınırlamak isteyip istemediğini sorar.
Çizimi kırılmamış parçalarla sınırlamak istemiyorsanız, Hayır'ı tıklatın. iTACS en fazla üç değişken çizebilir ve bu durumda, bu faktörler arasındaki ilişkiyi görmek için yalnızca iki değişken çizeceğiz. Monolayer stres mikroskopisinde veya MSM açılır menüsünde sonuç resmini seçin.
Konum dizini buradadır ve tamamlandığında Seç'i tıklatın. iTACS daha sonra başlangıç çerçevesini seçmemizi ister. Burada, iki numaralı kareyi seçtik.
Isı haritaları yapma seçenekleri, tek tek hücrelerin zaman izlerini çizme seçeneklerine benzer şekilde sunulur. Bununla, bir ısı haritasının nasıl yapılır olduğu sonucuna varıyoruz. Burada, bir numaralı hücre için sitoskeletal gerilimde hücresel hızın zaman izini temsil eder.
Özellikler paylaşılan bir dikey eksende gösterilir ve yatay eksen, çerçevelerin 15 dakikalık aralıklarla alındığı zaman örneği numarasını gösterir. İkinci çıkış, deneye bir saat kala bir dizi ısı haritasıdır. Burada gösterilen özellikler yayılma alanı, oryantasyon, dairesellik, hız, hareket yönü, maksimum gerilim yönelimi, sitoskeletal gerilim, substrat çekişleri ve bireysel hücrelerin gerilim anizotropisini içerir.
Yani bu bir dizi deneye bir bakış. AnViM ve AcTrM'nin kullanıcının deneyi tekrar tekrar yapmasına yardımcı olabileceği birkaç deneysel durum daha vardır ve bu kişiler el yazmasında listelenmiştir. iTACS'in temel özelliklerinden bazıları deneysel protokolün otomasyonu, otomatik veri analizi ve mühendislik arka planı gerekmez.
