Name: working with human tissues for translational cancer research
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Working with Human Tissues for Translational Cancer Research at JoVE.com

Bu çalışma, John G. ve Marie Stella Kenedy Memorial Vakfı (Hibe # 0727033) ve Melanom Araştırma İttifak hayırsever katkıları ile desteklenmiştir. Yazarlar Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, MD Anderson Kanser Merkezi Dairesi yanı sıra, doku dağıtımı, toplanması koordine ve translasyonel araştırma kolaylaştırmak için Texas MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Doku Bankası (ITB) University of teşekkür etmek istiyorum Patoloji ve Melanom Ay Shot Programı. Son olarak, yazarlar melanom etkilenen tüm hastalara ve ailelerine teşekkür etmek istiyoruz.

Etik bildirimi: Bu protokol Texas MD Anderson Kanser Merkezinde Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Numune Alımı <ol><li> Artı tümör ve ilgili normal dokudan 10-12 araştırma doku örneklerini toplayın. Islak buz üzerinde saklayın örnekleri otolitik önlemek için. </li><li> Patolojik tanı kolaylaştırmak amacıyla tüm dokuları, tıbbi cihazlar ve gerekli inceleme için Patoloji Anabilim bir cerrahi prosedür sırasında çıkarılan yabancı cisimlerin gönder. </li><li> Uygulanabilir araştırma ve doku bankacılığı politikaları ve prosedürlerine uygun olarak araştırma için ayrılan doku anlaştım. NOT: Biospecimen toplama patologlar koordinasyonunu gerektirir, patologlar &#39;yardımcıları, histotechnologists ve doku alım uzmanları. </li></ol> 2. Patoloji Kalite Güvencesi (QA) <ol><li> Tamamlayın ve erken QA önlem olarak hasta kayıtlarını doğrulamak ve teşhis pa gözden geçirmek için bir patolog danışmaktient kayıtları (patoloji raporları, doku slaytlar, vb) ve doku örnekleri. Böyle Bu biorepository en iyi uygulamalar 10-12 uyarınca vs tümör yüzdesi, nekroz, doku tümör arayüzü, gibi ilgi morfolojik özelliklerine Yargıç doku örnekleri. </li><li> İlk inceleme sonrasında, biospecimen kalış tüm uzunluğu boyunca biorepository verileri ve araştırma örneklerinin periyodik gözden yürütürler. </li><li> Numunelere histopatolojik ve diğer incelemelerden Bağlantı sonuçları ve açıklamalar ve özel bir biorepository yazılım sistemi aracılığıyla araştırmacılara bu veri sağlar. NOT: QA süreçleri biorepository operasyonların klinik ve teknik yönlerini hem de bütünlüğünü sağlamak. </li><li> Doğrulamak ve klinik kullanım için numune karakterize genetik ve moleküler testleri gerçekleştirin. </li><li> Toplayın ve laboratuar deneyleri için örnekler kullanıyorum araştırmacıların görüşlerine dayalı verileri analiz. ParçaBarkod teknolojisi kullanılarak örnekler. Bu elektronik izleme sistemi de biorespository en iyi uygulamalar 10-12 yılında savunulmaktadır. </li></ol> 3. Örnek / Doku İşleme <ol><li> Daima kendi doğal ortamından doku örneğinin çıkarılması tarafından uyarılan değişiklikleri sınırlamak amacıyla, mümkün olduğunca çabuk taze doku ıslak buz üzerinde örneklerin ve süreç saklayın. Süreç, normal tümör eşleşti ve tümör dokusu örnekleri ayrı ayrı çapraz bulaşmayı önlemek için. Not: Araştırma iletişim kurallarına göre, biospecimen işleme ortamının bir veya daha fazla tipte örneklerin toplanması içerebilir. </li><li> Işlemine başlamadan önce, steril Petri kültür çanak, bir neşter gibi doku işleme için bir iğne veya forseps hazırlamak. Borular, hazırlanan etiketli ve örnek işleme (Şekil 2) süresini sınırlamak amacıyla düzenlendiği emin olun. </li><li> Böyle hasta adı, numarası, tedavi, tarihi olarak tüm ilgili doku bilgileri,cerrahi, ve çalışma için uygun olabilecek diğer ilgili bilgileri, kurumsal bir doku veritabanında kolayca erişilebilir hale getirilmelidir. Sınırlı hasta bilgileri kağıt veya elektronik tablo şeklinde laboratuvarda yapılmalıdır. NOT:. Sadece araştırma viz doğası ile ilgili biospecimen bilgi toplamak, hastalığa özgü bilgiler için vb temel biyomedikal araştırmalar, klinik araştırmalar, translasyonel araştırma, biorepository personel için literatürde gerekli gördüğü bilgi ve yöneten organizasyonlar toplamak gerekir doğru tanı ve anlamlı araştırma sağlamak. Bu içerir, ancak tümör notları ve kanser evreleme bilgilerle sınırlı değildir. </li><li> Analiz, her tür, hem de oluk bezeme konumu için gerekli olan doku bölümleri büyüklüğüne karar verirse, tüm istenen sonraki deneyler planı. Imkansız olmasına rağmen İdeal olarak, tüm analizler doku heterogenei hesaba katmak amacıyla, tüm doku bölümünde temsilcisi olmalıdırty ve alt analizlerin sınırı önyargı. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi önceden gerekli tüm öğeleri yatırın. </li><li> Yüzeyine düz açık Petri kültür çanak doku örneği, yerleştirin. NOT: Sadece belirlenen örneklerin ele ve belirlenen sağlık verilerini yorumlayan biorepository personel yetkili izin ver. Müfettişler IRB tarafından düzenlenen imzalanan bilgilendirilmiş onayı ile izin verilen ve sadece bu hasta tanımlayıcılar erişebilirsiniz gerekir. Tüm örnekler yeterince etiketli olmalı ve en az bir benzersiz doku kimlik numarası ve doku tipi de içermelidir. HIPAA düzenlemelerine uygun olarak, etiketler herhangi bir PHI içermez. </li><li> Yapısı ve boyutları daha iyi anlamak için, tüm açılardan örneği inceleyin. Iğne ile çanak alt numuneyi Pin ve onun en büyük ve en iyi temsil eden eksen boyunca doku iki eşit parçaya böler geçin. </li><li> Doku küçük bir parça kesip ve steril bir 1.5 ml MICR yerleştirinRNA-stabilize edici çözeltinin 1ml içeren ocentrifuge tüpü. Bu örnek, işlemin geri kalan kısmı için buz üzerine yerleştirilmiş ve gerekli olana kadar, 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. NOT: RNA ile çalışırken, eldiven daima giyilmelidir ve RNAse ücretsiz filtre ipuçları bozulması ve RNA kirlenme ihtimalini sınırlamak için kullanılmalıdır. </li><li> Petri kültür çanak kapağı açık ve önceden etiketlenmiş biyopsi kasetini yatıyordu. 5 mm 3&#39;ten hiçbir kalın bir doku dilim kesip kaset aktarmak. 72 saat en az% 10 kaseti nötr tamponlu formalin (NBF) koyun. Parafin katıştırma önce uzun süreli depolama için% 70 etanol içinde kaset aktarın. Not: kasetlerin Etiketleme kalem ya da başka etiket silecektir işleme sırasında ksilen kullanımı önerilen belirteçler ile yapılmalıdır. </li><li> Doku parçası kesip bir doku kalıp yerleştirin. Optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşik doku bölümünü kapsayacak ve hemen dondurmakcryosectioning -20 ° C &#39;de. Bu doku kesiti cryosectioning için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Bir kesip veya dokuya birçok parçalar ve MACS tamponu ihtiva eden 50 ml&#39;lik bir tüp (1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS),% 0.5 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) sitometri analizi daha sonra akış aktarmak . Flow sitometri için gerektiğinde hücreler tümör disassociation, hücre fiksasyon ve permeabilization sırasında kaybolmuş olabilir gibi büyük numuneler tercih edilebilir. Genel olarak, bu bölüm sonunda alınabilir, bir kez tüm diğer parçaları işlenmiştir. Kalan temsili tümör örneği akış sitometrisi için kullanılabilmektedir. İsteğe bağlı olarak, bu tüp, 4 ° C&#39;de saklandı CO / H ya da bir hücre süspansiyonu (Adım: 4 - Akım Sitometrisi boyanması) içerisine akış sitometrik boyama hemen sonra sindirim için de kullanılabilir. </li><li> 0,5 mm x 0,5 mm maksimum boyutundan daha büyük parçalar hiçbir içine doku geri kalanını kesin ve Kriogen aktarabilirsinizSıvı azot içinde hızlı dondurulması şişeler. Gelecek analizleri ve işbirlikçi amaçlı bu çırpıda dondurulmuş numuneler kullanılabilir. NOT: Doğrudan temas ciddi yaralanmalara yol açabilir gibi sıvı azot ile çalışırken ekstra dikkatli olunmalıdır. Gözler Yan siperleri olan veya yüz kalkanı ile koruyucu gözlüklerle korunmalıdır. Dondurucu eldiven de sıçramasına ve doğrudan temas sonucu sıvı azot yanıklardan korumak için giyilmelidir. Eldivenler düzgün uygun ama bunların içine hızla gerektiği sıvı azot sıçrama kaldırılacak kadar gevşek olmalıdır. </li></ol> 4. Akış Sitometrik Boyama <ol><li> Doku Homojenizasyon <ol><li> DMEM (40 mi), DNase I (50 U / ml) ve kollajenaz l (2 mg / ml) ile sindirim orta hazırlayın. Petri kabı kapağı MACS tamponu taze veya O / N-depolanan tümör yerleştirin ve sindirim ortamı ile daldırın. NOT:. Farklı sindirim yöntemleri, mevcut avantajları ile her (yani, hücre yüzey proteini expression, canlılığı). İstediğiniz alt uygulama için uygun bir yöntem olduğundan emin olun. </li><li> Tümör macun benzeri bir dokuya sahiptir kadar dışarıdan bir iğne ile çanak alt ve kesim Pin tümörü, bir neşter ile merkezi. Sızıntıları önlemek için bir plastik torba içinde bir 50 ml tüp, mühür ve yere tümör karışımı aktarın. Bir kuluçka tüp aktarın ve 225 rpm, 37 ° C, 1 saat sonra döner. </li><li> Bir 70μm hücre süzgecinden tümör hücre süspansiyonu Filtre. 250 xg, 4 ° C&#39;de, 5 dakika santrifüjleyin hücre süspansiyonu. 1 ml FACS tamponu (500 ml PBS, 1 mi 0,5 M stok EDTA, 10 mi FCS ya FBS) yeniden süspanse hücre topağı. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve 1x10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden askıya. Aktarım boyama için bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde çukur başına 100 ul (10 6 hücre). </li></ol></li><li> Canlılık ve Antikor Boyama <ol><li> Her bir canlılık leke çözeltisi 200 ul de ilave et ve karıştır. IncuKaranlıkta 4 ° C&#39;da 30 dakika, için kesmek. 250 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> FACS tampon 200 ul yüzey antijenleri için (üretici göre) tarafından önerilen / titre konsantrasyonda antikor karışımı ekleyin. Karanlıkta 4 ° C&#39;de, 30 dakika hücreleri inkübe edin. 250 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> , FACS tampon 200 ul ile yıkayınız 250 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika ve aspire süpernatant hücreleri aşağı doğru döndürün. FACS tampon 200 ul hücre yeniden süspanse edin ve alımı ve analizi için akış sitometresi geçin. NOT: Hücre içi akış sitometri boyama gerçekleştirmek durumunda adımlarla 4.2.2 ile 4.2.3 arasında tespit ve permeabilization adımları ve hücre içi boyama gerçekleştirin. Sitokin boyama gerçekleştirmek için, hücreler, tavsiye edildiği gibi ön-aktifleştirilmiş önceki boyama olmalıdır, ve bu da monensin hücre içi protein taşıma ve salgılama inhibitörü aktivasyon sırasında kullanılan gerekençözünür faktörlerin tutulmasını sağlamak. Sabit hücreler bir akış sitometresi üzerinde koyu önce ediniminde 4 ° C&#39;de kısa vadeli (bir hafta) saklanabilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines.">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li><li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies.">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , (2010).</li><li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+disease.">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li><li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters.">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li><li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Preservation.">Tissue Preservation.</a> Advances in Biopreservation. , 157-159 (2006).</li><li>Bulmer, M., Gilbert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ethics+of+social+research.">The ethics of social research.</a> Researching social life. , 45-57 (2001).</li><li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IRB guidebook. , (1993).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures. 3, (2009).</li><li>Ruffell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+composition+of+human+breast+cancer.">Leukocyte composition of human breast cancer.</a> Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical flow cytometry. , (2005).</li><li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li><li>Chung, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissue.">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays.">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li><li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis.">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li><li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis.">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li><li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages.">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li><li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+thermodynamic+stability+of+DNA,+RNA,+and+DNA:RNA+hybrid+duplexes:+relationship+with+base+composition+and+structure.">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li><li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+microarrays+and+proteomics.">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Sonuçta, işleme yöntemleri, istenen hipotez tarafından dikte ve (Şekil 1) yapılacak teknik testlerin tahmin edilmelidir. Aşağıdaki bölüm, doku kesitlerinde gerçekleştirilebilir potansiyel tahlilleri açıklamak için özet olarak hizmet vermektedir. Hiçbir ayrıntılı bir bakış anlamına gelir, ama teknikleri anlatan ve onların güçlü ve zayıf yönlerini listeleyerek kılavuz örnek işleme yöntemleri ve alt testlerin seçimi yardımcı olmak için tasarlanmıştır gereğidir. Boyama Flow cytometry taze parçalara doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir, ya da fragmanları, 4 ° C&#39;de MACS tamponu O / N saklanır. Sitometrisi oldukça spesifik fenotiplendirilmesini ve doku örneklerinden alınan hücre popülasyonlarının analizi kolaylaştırır ve tek bir hücre içerisine 17 hücre yüzey belirteçleri ve hücre içi proteinlerin, sitokinler ve proteazlar lekelenmesini sağlar akış. Ayrıca, bazı sitometre localizat belirlemek amacıyla, tek bir hücre büyütme izinhücre içindeki proteinlerin iyon yerine sadece pozitifliği ve sinyallerin yoğunluğu. Son olarak kütle sitometrisi olumsuz hücreler lize edildi ve bu nedenle daha fazla kültürlendi olmayabilir kriteri, ya da bütün olarak 14 rakamı ile analiz edilmesi gerektiğini olmak üzere aynı örnek 35 &#39;in protein ölçülmesini sağlar. Bu teknik, tek hücre düzeyinde birçok belirteç ve proteinlerin analizi yanı sıra ayrıntılı karakterizasyonu sağlar. Ancak, akış sitometrisi, doku homojenizasyon ve doku yapısının kaybına gerektirir hücre fenotipinde değişiklikleri en aza indirmek için taze doku üzerinde gerçekleştirilmelidir. Bazı hücre alt iskemi karşı daha savunmasız olabilecek önemlisi, hücre içeriğini etkileyebilir flow sitometri yönelik doku depolama erteledi. Fosfoproteinler da kötü işleme kinetiği 15 suboptimal sitometri ise akış ile tespit edilebilir. Formalin fiksasyonu ve doku kesitlerinin parafin gömme (FFPE) durumunda en iyi seçim olabilirBu gerçekleştirilebilir tahlillerin tipler, yüksek esneklik sağlar, çünkü gelecekte ilişkin belirsizlik, analiz eder. Geleneksel, FFPE bölümleri immünohistokimyasal (İHK) ya da immünfloresans (IF) boyama 5 mikron bölüme bir mikrotomda kesitli. Bununla birlikte, FFPE dokular iyi korunmuş ve bu nedenle farklı amaçlar için kullanılabilmektedir. Aslında, FFPE bloklardan daha kalın bölümleri kesme DNA ve RNA ekstraksiyonu ticari olarak temin edilebilen kitler ile birlikte, hem de ters-faz proteini dizisi (RPPA) analiz 16-18 hem sağlar. Bu duruma göre, FFPE içine işleme doku örnekleri daha fazla esneklik gibi olanaklar, hem de immün doku yapısını koruyarak ve dolayısıyla doku yapılarının ve hücre popülasyonlarının tasviri benzeri in vivo olarak daha doğru bir temin etme avantajına sunabilir. Doku kesitleri zaman uzun süreler için muhafaza edilmesi için FFPE sağlar. Bu teknik, bununla birlikte, bazı olumsuz özelliğe sahiptir. FFPE için kullanılan ince kesitler yapmaksıralı kesimler ve doku kesitlerinde doku heterojenite için hesap böylece RNA ve DNA kalitesini olumsuz yönde etkileyen bir kez ortam havasına maruz okside başlar. Nihayet, çapraz bağlanma, FFPE bölümlerde IHC birden fazla proteinin beraber boyama optimizasyon gerektirir. IHC veya IF ile mikroskopi istendiğinde, bir Ekim bileşiğin kullanılması tercih edilir. Ekim-depolanmış bölümler İHK ve IF için slaytlar üzerine yerleştirilir ve kullanılmadan önce kriyotom ile kesilmelidir. Ekim antijenitesini korur ve mikroskopi için en uygun tekniği yapım arka plan en aza indirir. Ekim de NBF birkaç gün gerektiren FFPE göre acil dondurma ve kesme verir. Bu faydalarına rağmen, Ekim genellikle daha az istikrarlı ve sadece İHK ve IF Ekim gömülü doku kesitlerinden yapılabilir çünkü FFPE daha az esnektir. RNA analizi ile ilgili olarak, numuneler daha RNA e sağlayan, zamanla sertleşebilmesi RNA stabilize çözeltisi içinde 4 ° C&#39;de saklandıdiğerleri arasında ticari olarak temin edilebilen çıkarma kitleri ve TRIzol aracılığıyla xtraction. RNA ekstraksiyonu, izin alt transkribe genler, RNA dizi analizinde ekspresyonunu ölçmek için ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve mikro-tahlil ile modüle edilmiş genlerin geniş spektrumlu analizleri veya nanoString analizi gibi analiz eder. Bu duruma göre, doku RNA izolasyonu gen ekspresyonu ve tedaviler ve hastalıkları olan yollar hakkında geniş bilgi sağlayarak son derece yüksek verimli olabilir. Önemlisi, ancak RNA ifadesi büyük ölçüde doku yapısı ve örnekleme büyüklüğüne göre değişebilir, bu nedenle ekstra bakım toplamanın önlemek için örnekleme konumu nedeniyle analizleri alınmalıdır. Ayrıca, RNA niteliği ifade seviyelerinde dinamik değişimler, bu nedenle ekstra bakım da genleri ve ilgi 19,20 yollarını incelemek için takip edilmektedir uygun kinetik sağlamak için alınması gereken oluşabilecek düşündürmektedir; işleme RNA stabilize s çekimini takiben sınırlı olmalıdıristikrarı sağlamak için Ç ÖZÜM. Buna göre, tamamlayıcı DNA depolama artan istikrar (cDNA) RNA tercih edilir (eğer aşağı analiz doğrultusunda) 21. RNA, genellikle alt analizlerde amplifiye edilebilir, çünkü son olarak, kirletici hücre dakikalık fraksiyonlar elde edilen sonuçlar büyük önyargılara neden olabilir. DNA analizi daha önce hızlı bir şekilde dondurulup doku örnekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir ya da FFPE doku kesitleri üzerinde olabilir. Bu yöntemler daha sonraki bütün exome veya tüm genom dizileme, çoklu hastalık bağlamlarda hasta yanıtı ve prognozu bağlantılı mutasyonların ve polimorfizmin belirlenmesi yoluyla muazzam söz göstermiştir iki teknik sağlar. DNA izolasyonu başka antijenlerin ve tedavi ve hastalık 20,21 bağışıklık tepkisi ile ilgili bilgiyi elde etmek için, T-hücresi ve B hücresi reseptörünün (TCR ve BCR) numuneleri içinde bulunan dizileri belirlenmesi izin verebilir. RNA ile karşılaştırıldığında, DNA, ancak oldukça dengeli bir kez ekstre olduğuo hesap transkripsiyonel ve genlerin translasyonel regülasyonu yanı sıra post-translasyonel modifikasyonlar ve yönetmelik 22 içine alır. Protein Western blot gerçekleştirmek amacıyla doku bölümleri veya FFPE örnekleri hızlı bir şekilde dondurulup şirketinden ekstre edilebilir protein etkileşimleri ve ağlar tespit etmek ko-immünopresipitasyon, hem de RPPA, yüzlerce göreli sayılmasına olanak tanıyan yüksek verim analiz tekniğinin tek bir örnek 23 proteinler. Ancak, bu teknik, sadece özel antikorların kendi ihtiyacına ile bilinen proteinlerin belirlenmesini sağlar. Önemli bir şekilde, bundan başka translasyon sonrası modifikasyon analizi, örneğin protein fosforilasyon gibi kararsızlık 15 nedeniyle dokusunun hızlı işlem gerektirmektedir. Örneklerin Yapış-dondurma basit ve sınırlı kaynakları gerektirir. Aşağı analizler henüz belirlenmiş değil zaman da dışında, numunelerin uzun vadeli depolanmasına olanakTaze numuneler üzerinde yapılması gereken akış sitometrisi örneği. Yapış dondurulmuş örnekler de kolayca işbirliği amacıyla paylaşılabilir. Sonuç olarak, bir doku tek bir parça elde edilebilir veri miktarı sınırsızdır. Tahlilleri herhangi bir çalışmada yapılmalıdır hangi evrensel doğru cevabı vardır. Her araştırmacı bu nedenle bu dramatik çalışmaların tasarımı ve elde edilen cevaplar etkileyebilir olarak o / o, hasta alımı ve doku işlemeden önce dikkate tüm hipotezler, istenen deneyleri yanı sıra mevcut kaynakları alır emin olmalısınız.

Tıbbi araştırma, insan hücre hatları ve hayvan modellerinde hem çalışma son derece yararlanmıştır. Hücre çizgileri iyi bir sistem elemanlarının kontrolü, hem de uygun organizmadan hücrelerin kullanımı için izin verir. Hücre hatları yanıtları 1 etkileyebilecek diğer hücrelerin, stromal bileşenleri ve organların etkisini özetlemek değil, çünkü daha fazla temsilcisi olurken, sağlık ve hastalık sorumlu olabilir mekanizmalarının büyük ölçüde basitleştirilmiş anlık sunar, insan hücreleri ile çalışma. Öte yandan, hayvan modelleri, insan hastalığını ve genetik heterojenite üreyen tamamen doğru olmasa da, çoğu modelde 2,3 bütün hayvan sistemlerinin giriş için izin vererek daha fazla fikir sunar. Eksiklikleri bir yana, her iki yöntemin de yararları var ve tamamlayıcı niteliktedir. Ancak, ana hedefi bir tam vücut, çoklu organ sisteminde insan hücreleri ve organları, çalışma devam etmektedir. Bu duruma göre, geleneksel araştırma tak sahipDaha iyi mekanizmaları altta yatan hastalığın kavramak için, insan organları ve hastaların çıkarılan dokuların çalışma kolaylaştırmada büyük adımlar tr. Translational araştırma ve böylece, tüm vücutta ve uygun hücrelerde tedavileri ve hastalıkların sonuçlarını okuyan hücre ve hayvan çalışmaları 4 arasında iki dünyanın en iyi sağlama avantajı sunuyor. Translational araştırma kusurları olmadan da değil. Insan hastalardan hasat edilen örnekler, ana bilgisayardan uzaklaştırılması üzerine hemen iskemi ve başka bir şekilde korunacak olan, diğer dış faktörlerle tabi tutulur. Bu stres kaynaklı moleküler ve genetik değişikliklere neden olur ve daha sonraki çalışmalarda önyargı neden olabilir. Bu nedenle, çok çaba en aşağı çalışmalar için 5 organ ve hücre bütünlüğünü korumak için sıkı yöntemlerle dokuların çıkarılması ve işlenmesi girmiştir. Yöntemleri o seçerken önemlisi, gelecekteki uygulamalar yakından ele alınmalıdırf belli yöntemler hücresel bileşenleri için zararlı olabileceğinden, insan örnekleri işleme ve diğerleri tutumlu sırasında sinyal yolları. İnsan dokuları içeren herhangi araştırma, düzenleyici konular ele alınmalıdır. Tuskegee ve Belmont raporlar sonrasında, biyomedikal araştırma doğasında riskler genellikle kaçınılmaz etik ikilemler 6 sonuçlanan ile ilişkili olduğu gerçeğini büyüyen bir kabul vardı. Ulusal standartlara ihtiyaç tanındı ve federal hükümet Belmont Raporu ilkelerine uyulması (kişiler, Yararlılık, Adalet için saygı) için bir araç olarak Kurumsal Gözden Kurulları (IRBs) oluşturuldu. Herhangi bir kurumun IRB araştırma katılımcılarının korumakla yükümlüdür doktorlar, araştırmacılar ve topluluk üyeleri bir kuruldur. Gönüllü rıza biyomedikal araştırma çalışmalarının tüm katılımcıların elde gerektirir ve bu rıza bir aydınlatılmış onam fo belgelenmiş olması<html> rm. Bilgilendirilmiş onam süreci bilinçli bir karar çalışmaya kayıt veya katılım devam edip etmemeye yapılabilir böylece, bir katılımcının yeterli bilgi vermeyi amaçlamaktadır. Bu bağlamda, bilgilendirilmiş onam belge iyi okunabilirliği olmalı ve kolayca hedef nüfusun (6 th 8 inci sınıf okuma seviyesi) anlayabileceği dilde yazılmış olmalıdır. Baskı veya uygunsuz etkiden olasılığı minimize edilmelidir, ve konu katılımını dikkate için yeterli zaman verilmelidir. Katılımcı da ceza olmadan çalışmanın seyri sırasında herhangi bir aşamada onayı geri alma hakkını kullanmasına izin verilmelidir. Gönüllü bilgilendirilmiş onam araştırma gönüllünün katılımı için zorunlu ön koşulu ve aynı zamanda 7 hukuken etkilidir. Insan korunması için yönetmelik gereğince konular 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), çalışmaya katılanların araştırma amacı haberdar edilmelidir, araştırmaya katılan prosedürleri, katılım alternatifleri, topluma ve muhtemelen tek araştırma tüm öngörülebilir riskler ve rahatsızlıkları (sadece fiziksel yaralanma, aynı zamanda mümkün psikolojik, sosyal ya da ekonomik zarar, rahatsızlık ya da rahatsızlık dahil), faydaları, konu katılması bekleniyor zamanın uzunluğu, kişi katılım gönüllü olduğunu belirten açıklamada, soruların ya da araştırma ile ilgili yaralanma ya da acil durumlarda cevaplar için iletişim ve katılmak için bu reddin, düzenli klinik bakım bir uzlaşma olarak herhangi bir sonuç veya faydalar herhangi kaybına neden olmaz katılımcı aksi hakkı olduğunu gizlilik ve çekilme hakkına kişinin hakkına ilişkin nihayet bir açıklama onun / onu tanı sonucu almak veherhangi sonuçları olmadan herhangi bir zamanda çalışma. Çalışmanın süresince onayı geri katılımcılardan doku örnekleri banked edilmemelidir ve hemen tükenmiş olması gerekir. Aydınlatılmış onam bir ya da daha fazla eleman feragat pratik gerekli unsurlara veya gerekli unsurlar uygulanabilir olmadığında çalışmalar için bir değişiklik olmadan yapılamaz olabilir bazı araştırma projeleri için IRB elde edilebilir. Büyük bir dikkatle veri gizliliğini sağlamak için alınmalıdır. Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) kullanarak veya katılımcıların yazılı izni olmadan &quot;Korumalı Sağlık Bilgileri&quot; (PHI) ifşa engelleyen bir federal yasa olduğunu. PHI içerir, ancak sağlık bilgileri iletilen veya muhafaza herhangi bir biçimde ya da orta ve bireysel 9 tanımlamak için kullanılabilir alanları içerir ile sınırlı değildir. Bu çalışma sayesinde, biz Tissu&#39;nun sırasında uyulması gereken protokol anahat hedefliyoruze işleme - tedarik dahil, depolama ve doku çıkarma üzerine maruz streslere bağlı olarak meydana gelebilir önyargıları en aza indirecek şekilde bu katı yönergeleri izleyerek önemini vurgulamaktadır. Okuyucular Ne tahlil (ler) en iyi onların ihtiyaçlarına uygun nitelikli bir yargıya böylece biz de aşağı tahlillerde ya da bu tür örnekler üzerinde yapılabilecek analizler (Şekil 1) kısa bir özetini sunmak için gayret.

<table><tbody><tr><td>Needles</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel disposable scalpels</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Cassettes</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>RNA-stabilizing solution</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tubes</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Containers</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Optimal cutting temperature solution (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&amp;mu;m cell strainers</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 well round bottom plates</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead stain solution</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>

working with human tissues for translational cancer research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human specimens, precious samples must be handled with the greatest care in order to ensure integrity of organs, tissues, and cells to the highest degree. Unfortunately, tissue processing by definition requires extraction of tissues from the host, a change which can cause great cellular stress and have major repercussions on subsequent analyses. These stresses could result in the specimen being no longer representative of the site from which it was retrieved. Therefore, a strict protocol must be adhered to while processing these specimens to ensure representativeness. The desired assay(s) must also be taken into consideration in order to ensure that an optimal technique is used for sample processing. Outlined here is a protocol for tissue retrieval, processing and various analyses which may be performed on processed tissue in order to maximize downstream production from limited tissue samples.

<html> Aşağıda gösterilen sonuçlar işlenmiş bir melanom tümör üzerinde geniş bir immün fenotipleme için akış sitometri yolluk stratejisini betimliyor. Boyama gün, doku numunesi 225 RPM dönme altında, 37 ° C&#39;de, sindirilmiş ve kolajenaz I ve 60 dakika boyunca kuluçkalama DNase I ile homojenize edildi. Sindirme işlemini takiben, bir hücre süspansiyonu artıkları yok etmek için 70 mikron hücre süzgecinden süzüldü ve hücreler, immün hücre fenotipleme antikorlar sitometri floresan etiketli akışı ile boyandı. MACS tamponu içinde 4 ° C de, doku depolanmış O / N birden fazla marker için yolluk stratejisi ve boyama (Şekil 3) altında gösterilmiştir. Gösterildiği gibi, 4 ° C &#39;de MACS tamponu tarif depolanmıştır O / N gibi işlenmiştir örnekler, son derece sınırlı mortalite göstermektedir. Bundan başka, bu rakam yukarıda tarif edildiği gibi olduğu işlem doku melanoma tümörlerinin immün hücre alt çok renkli geniş bir fenotipleme sağlar göstermektedir. s / ftp_upload / 53189 / 53189fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil insan kan ve doku örnekleri yapılabilir 1. Analizler. Aşağıdaki işlem yapılabilir deneyleri bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53189/53189fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53189/53189fig2.jpg" /> Uygun doku işleme ve depolama. Doku işleme kurulum Örnek için gerekli 2. Öğeler Şekil. Doku iğne ve neşter ile Petri kültür kaplarına (A) parçalara olabilir. Doku Temsilcisi parçaları daha sonra oda sıcaklığında üç gün sabitleme için NBF konteyner (C) transfer edilmelidir biyopsi kaset (B) transfer edilmelidir. Doku Bir parça, b daha önce Ekim çözelti içinde cryomold (D) içine yerleştirilmiş ve kapalı olmalıdır-20 ° C&#39;de dondurularak Eing. Doku Büyük bir parça boyama akış sitometrisi için 50 ml&#39;lik bir tüp (E) transfer edilmelidir ve MACS tamponunda O / N 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Doku küçük bir parça RNA stabilize edici çözelti (F) ile bir 1.5 ml&#39;lik tübe aktarılarak RNA ekstraksiyonu kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilmelidir. Son olarak, artık doku parçalar halinde kesilir ve sıvı nitrojen ve uzun süreli depolama geçmeli dondurma cryotubes (G) transfer edilmelidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53189/53189fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53189/53189fig3.jpg" /> Geniş bağışıklık fenotipleme için Şekil 3. Akış sitometrik yolluk stratejisi. 4 ° sitometri melanom tümör saklanan O üzerinde akış / N tarafından geniş bir immün fenotipleme yolluk stratejisinin Örnek;. C MACS tamponu 13 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53189/53189fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Working with Human Tissues for Translational Cancer Research at JoVE.com

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

9.8K Görüntüleme.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Translational cancer research is dependent on extraction of human tissues. Much work has gone into optimizing extraction methods for ex vivo analysis. Here, we describe tissue processing methods allowing for maximal data output from limited samples.

Video: Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

İnsan 3D Doku Mühendisliği<em&gt; In vitro</em&gt; Tümör Test Sistemi

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Biyomühendislik

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic target analyses and drug response monitoring using patient derived xenografts (PDX). This strategy was validated using ovarian tumors as an example. The mate-pair next generation sequencing (MPseq) protocol was used to identify structural alterations and followed by analysis of potentially targetable alterations. Human tumors grown in immunocompromised mice were treated with drugs selected based on the genomic analyses. Results demonstrated a good correlation between the predicted and the observed responses in the PDX model. The presented approach can be used to test the efficacy of combination treatments and aid personalized treatment for patients with recurrent cancer, specifically in cases when standard therapy fails and there is a need to use drugs off label.

Here we present a protocol to test the efficacy of targeted therapies selected based on the genomic makeup of a tumor. The protocol describes identification and validation of structural DNA rearrangements, engraftment of patients&#8217; tumors into mice and testing responses to corresponding drugs.

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Kanser Araştırmaları

Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine cancer models are extremely limited in their diversity and suffer from poor translation to the clinic. To serve as a more physiological preclinical model for immunotherapy studies, this protocol has been developed to evaluate the treatment of human tumors in a mouse reconstituted with a human immune system. This unique protocol demonstrates the development of human immune system (HIS, &#34;humanized&#34;) mice, followed by implantation of a human tumor, either a cell-line derived xenograft (CDX) or a patient derived xenograft (PDX). HIS mice are generated by injecting CD34+ human hematopoietic stem cells isolated from umbilical cord blood into neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2R&#947;C-/- NODSIRP&#945;) highly immunodeficient mice that are also capable of accepting a xenogeneic tumor. The importance of the kinetics and characteristics of the human immune system development and tumor implantation is emphasized. Finally, an in-depth evaluation of the tumor microenvironment using flow cytometry is described. In numerous studies using this protocol, it was found that the tumor microenvironment of individual tumors is recapitulated in HIS-PDX mice; &#34;hot&#34; tumors exhibit large immune infiltration while &#34;cold&#34; tumors do not. This model serves as a testing ground for combination immunotherapies for a wide range of human tumors and represents an important tool in the quest for personalized medicine.

This protocol outlines the generation of human immune system (HIS) mice for immuno-oncology studies. Instructions and considerations in the use of this model for testing human immunotherapeutics on human tumors implanted in this model are presented with an emphasis on characterizing the response of the human immune system to the tumor.

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Reversing the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment is critical for the successful treatment of cancers with immunotherapy drugs. Murine ...

Pankreas Kanseri Kaynaklı Tümör Organoidleri ve Taze Dokudan Fibroblastlar

Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. Patient-derived tumor organoids have been used in translational cancer research and can be applied to assess treatment sensitivity and resistance, cell-cell interactions, and tumor cell interactions with the tumor microenvironment. Tumor organoids are complex culture systems that require advanced cell culture techniques and culture media with specific growth factor cocktails and a biological basement membrane that mimics the extracellular environment. The ability to establish primary tumor cultures highly depends on the tissue of origin, the cellularity, and the clinical features of the tumor, such as the tumor grade. Furthermore, tissue sample collection, material quality and quantity, as well as correct biobanking and storage are crucial elements of this procedure. The technical capabilities of the laboratory are also crucial factors to consider. Here, we report a validated SOP/protocol that is technically and economically feasible for the culture of ex vivo tumor organoids from fresh tissue samples of pancreatic adenocarcinoma origin, either from fresh primary resected patient donor tissue or patient-derived xenografts (PDX). The technique described herein can be performed in laboratories with basic tissue culture and mouse facilities and is tailored for wide application in the translational oncology field.

Yazar Spotlight: Pankreas Kanseri Kaynaklı Tümör Organoidlerinin ve Taze Dokudan Fibroblastların Kurulması  

Tumor organoids have revolutionized cancer research and the approach to personalized medicine. They represent a clinically relevant tumor model that allows researchers to stay one step ahead of the tumor in the clinic. This protocol establishes tumor organoids from fresh pancreatic tumor tissue samples and patient-derived xenografts of pancreatic adenocarcinoma origin.

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Tumor organoids are three-dimensional (3D) ex vivo tumor models that recapitulate the biological key features of the original primary tumor tissues. ...

Mikroakışkan Tabanlı Vaskülarize İnsan Mikro Tümör Modelinin Hazırlanması

Establishing a Physiologic Human Vascularized Micro-Tumor Model for Cancer Research

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical cancer research and therapeutic development.&#160;To overcome this problem, we have developed the vascularized microtumor (VMT), or tumor chip, a microphysiological system that realistically models the complex human tumor microenvironment. The VMT forms de novo within a microfluidic platform by co-culture of multiple human cell types under dynamic, physiological flow conditions. This tissue-engineered micro-tumor construct incorporates a living perfused vascular network that supports the growing tumor mass just as newly formed vessels do in vivo. Importantly, drugs and immune cells must cross the endothelial layer to reach the tumor, modeling in vivo physiological barriers to therapeutic delivery and efficacy. Since the VMT platform is optically transparent, high-resolution imaging of dynamic processes such as immune cell extravasation and metastasis can be achieved with direct visualization of fluorescently labeled cells within the tissue. Further, the VMT retains in vivo tumor heterogeneity, gene expression signatures, and drug responses. Virtually any tumor type can be adapted to the platform, and primary cells from fresh surgical tissues grow and respond to drug treatment in the VMT, paving the way toward truly personalized medicine. Here, the methods for establishing the VMT and utilizing it for oncology research are outlined. This innovative approach opens new possibilities for studying tumors and drug responses, providing researchers with a powerful tool to advance cancer research.

Yazar Spotlight: Translasyonel Kanser Araştırmaları için Model Olarak İnsan Vaskülarize Mikro Tümörleri Oluşturma 

This protocol presents a physiologically relevant tumor-on-a-chip model to perform high-throughput basic and translational human cancer research, advancing drug screening, disease modeling, and personalized medicine approaches with a description of loading, maintenance, and evaluation procedures.

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

A lack of validated cancer models that recapitulate the tumor microenvironment of solid cancers in vitro remains a significant bottleneck for preclinical ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Translational Kanser Araştırma İnsan Doku ile Çalışma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İnsan 3D Doku Mühendisliği

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

İnsan Tümörleri Taşıyan İnsanlaştırılmış Bir Fare Modelinde Kanser İmmünoterapötiklerinin Test Edilmesi

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Taze dokudan pankreas kanseri kaynaklı tümör organoidlerinin ve fibroblastların oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil