Erken gelişim sırasında annelik tarafından eksprese edilen birçok genin rolü şu anda bilinmemektedir. Bu maternal CRISPR tekniği, maternal etki genlerinin ve gelişimdeki rollerinin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. RNA'ları tek bir gene multipleks yönlendirmek, araştırmacıların tek bir nesilde yeni maternal etki fenotiplerini tanımlamalarını sağlar.
Bu araştırma, erken embriyogenez için gerekli olan gametlerdeki mRNA transkriptlerinin işlevini anlamak için faydalıdır. Bu tekniğin anahtarı, embriyoları bir hücre aşamasının başlarında mikro enjekte etmek ve kılavuz RNA'ların çoğunluğunun enjekte edilen embriyolarda somatik mutasyonlar yapabileceğini kontrol etmektir. Her gen spesifik oligonükleotid için bir kılavuz RNA şablonu oluşturmak için, sabit oligonükleotidi analitleyin ve çıkıntıları T4 DNA polimeraz ile doldurun.
Dört kılavuz RNA şablonu bir araya getirildikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak bunları saflaştırın ve konsantre edin. Bir in-vitro T7 transkripsiyon kiti kullanarak havuzlanmış adam RNA şablonundan sgRNA karışımını sentezleyin ve makalede açıklandığı gibi in vitro transkripsiyonu gerçekleştirin. SgRNA'nın bütünlüğünü doğrulamak için, mililitre başına% 1 agaroz 0.5 mikrogram, ethidyum bromür Tris-Borate-EDTA jeli dökün.
Katılaştırılmış jeli Tris-Borate-EDTA çalışma tamponuna yerleştirin. Bir mikrolitre sgRNA karışımını ve bir mikrolitre RNA jel yükleme tamponunu karıştırın. Bu numuneyi jele yükleyin ve jeli beş dakika boyunca 100 voltta çalıştırın.
Ultraviyole ışık kullanarak bantları görselleştirin. Vahşi tip haçlar ve zebra balığı çiftleşme kutuları kurun. Erkek ve dişi balıkları aynı tankta tutun, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü kullanarak veya burada gösterildiği gibi, dişi bir yumurtlama ekinin içine yerleştirerek ayırın.
Enjeksiyon kokteyli monte edildikten sonra, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya burada gösterildiği gibi, erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek erkek ve dişinin çiftleşmesine izin verin. Embriyoları senkronize etmek için, plastik bir süzgeç kullanarak 10 dakika sonra toplayın ve 1XE3 ortamı kullanarak bir Petri kabında durulayın. 10 ila 15 embriyoyu çıkarın ve enjekte edilmemiş kontroller olarak tutulmak üzere ayrı bir Petri kabına yerleştirin.
Kalan embriyoları enjeksiyon plakası kuyucuklarına aktarın. Bir nanolitre protein sgRNA çözeltisini, bir hücreli embriyonun gelişmekte olan blasto diskine enjekte edin. Tıkanmış iğnenin ucunu kırmak için forseps kullanın ve bir nanolitrelik bolusu çıkarmak için iğneyi yeniden kalibre edin.
Enjeksiyondan sonraki ertesi gün, enjekte edilmemiş plakadan altı sağlıklı enjeksiyonlu embriyo ve iki kontrol embriyosu toplayın. Her embriyoyu ayrı ayrı bir PCR şerit tüpünün tek bir kuyucuğuna yerleştirin ve tüplerin üstünü etiketleyin. CRISPR-Cas9 hedef bölgesini içeren 100 ila 110 baz eşleştirilmiş DNA parçasını yükseltmek için her kılavuz bölge için benzersiz tarama primerleri tasarlayın.
Mümkünse, hedef siteyi güçlendirilmiş parçanın ortasına yerleştirin ve daha büyük silmelerin tanımlanmasına izin verin. Dört kılavuz hedef bölgenin her biri için, hazırlanan tek embriyogenomik DNA'nın beş mikrolitresini ve PCR karışımının 20 mikrolitresini kullanarak sekiz adet 25 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın ve hedef bölgedeki somatik mutasyonları tanımlamak için spesifik tarama primer karışımını yönlendirin. Yaklaşık 0.625 santimetre genişliğinde kuyucuklar oluşturan tarakları kullanarak% 2.5 agaroz, mililitre ethidyum bromür başına 0.5 mikrogram Tris-Borate-EDTA jeli dökün.
Daha sonra katılaşmış jeli Tris-Borate-EDTA çalışma tamponu içeren elektroforez odasına yerleştirin. PCR ürününe beş mikrolitre 6X yükleme boyası ekleyin. Bu karışımın 25 mikrolitresini jele yükleyerek enjekte edilen ve kontrol edilen numunelerin aynı jel sırası üzerinde çalıştığından emin olun.
Tüm numuneler yüklendikten sonra, jel kutusunun pozitif ucuna bir litre Tris-Borate-EDTA çalışma tamponu başına beş mikrolitre ethidyum bromür ekleyin. DNA yasakları çözülene veya DNA şeridin sonuna yaklaşana kadar jeli 120 voltta çalıştırın. Maternal etki fenotiplerini ve maternal CRISPR'nin embriyolarını tanımlamak için, F0 enjekte edilen dişileri vahşi tip erkeklere karşı ayarlayın ve deneyden önceki öğleden sonra standart zebra balık çiftleşme kutularında vahşi tip haçları kontrol edin.
Erkek ve dişi balıkları aynı tanka yerleştirin, ancak bir çiftleşme kutusu bölücüsü ile ayırın veya dişiyi bir yumurtlama ekinin içine yerleştirin. Deneyin sabahında, çiftleşme kutusu bölücüsünü çıkararak veya erkeği dişi ile aynı yumurtlama ekine yerleştirerek erkek ve dişinin çiftleşmeye başlamasına izin verin. Yumurtlama ekini taze sistem suyu içeren yeni bir çiftleşme tankı tabanına hareket ettirerek embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve tankı bireysel F0 dişisini tanımlayan bir etiketle etiketleyin.
Eski çiftleşme tankını alın ve embriyoları 10 dakikalık bir debriyajdan toplamak için suyu bir T-süzgeçten dökün. Aşkın bir ışık kaynağına sahip diseksiyon mikroskobu altında, her saat, ilk altı ila sekiz saat boyunca ve sonraki beş gün boyunca günlük olarak gelişim gösteren embriyoları gözlemleyin. Potansiyel maternal CRISPR embriyolarını 1XE3 ortamı içeren bir Petri kabına taşıyın ve döllenmeden 24 saat sonra morfolojik fenotip için tahlil ve döllenmeden beş gün sonra yaşayabilirlik.
Deneyden önceki öğleden sonra, vahşi tip erkekleri fiziksel olarak dişilerden ayrı tutarak, bir çiftleşme kutusu bölücü kullanarak veya dişi yumurtlama ekine yerleştirerek F0 dişi çiftlerini ayarlayın. Deneyin sabahında, çiftleşmeyi başlatmak için fiziksel bölümü çıkarın. Yumurtlamanın ilk belirtisinde, erkek ve F0 dişilerini ayırarak üremeyi kesin ve her bir ayrılmış F0 dişisini ayrı çiftleşme kutularında tutun.
İn-vitro fertilizasyondan sonra, maternal CRISPR fenotipi gözlenene kadar haploid embriyoların gelişmesine izin verin ve bu embriyoları farklı bir Petri kabına yerleştirin. Maternal CRISPR haploid embriyoları tanımlandıktan sonra, döllenmeden sonra en az altı saat boyunca gelişmelerine izin verin. Genomik DNA'yı en az 10 maternal CRISPR haploid embriyosundan çıkarmak için, tek bir haploid embriyoyu bir PCR şerit tüpünün ayrı bir kuyucuğuna yerleştirin, fazla E3 ortamını kuyudan çıkarın ve 50 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin.
Embriyoları 95 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin ve dört santigrat dereceye kadar soğutun. Daha sonra pH 7.5 ile bir molar Tris-hidroklorik asitten beş mikrolitre ekleyin ve beş ila 10 saniye boyunca vorteks yapın. Hangi kılavuz bölgelerinin indeller içerdiğini belirlemek için, dört CRISPR / Cas9 hedef bölgesinin tümünü içeren bir DNA parçasını yükseltmek için dizileme primerleri tasarlayın.
Hazırlanan genomik DNA'nın beş mikrolitresini ve dizileme primerlerini kullanarak embriyo başına iki adet 25 mikrolitre PCR reaksiyonu ayarlayın. PCR bittikten sonra, bir DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak iki numuneyi saflaştırın ve konsantre edin ve DNA fragmanını ileri ve geri dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilemesine gönderin. Kılavuz RNA'ların hepsi, maternal CRISPR'nin üretimi sırasında kılavuz RNA'lar arasında en az örtüşen bölgeler veya hiç örtüşmeyen bölgelerle birlikte kümelenmelidir.
İndels oluşturulduysa, bir agaroz jeli üzerindeki enjekte edilen numunelerde bir smear gözlenmeli, ancak enjekte edilmemiş kontrolde gözlenmemelidir. Maternal CRISPR yöntemi, rengarenk, tmi ve aura gibi bilinen maternal etki mutasyonlarını fenotoskopik için kullanılabilir. Maternal CRISPR-fenotipine katkıda bulunan genetik lezyonları tanımlamak için, UV ile tedavi edilmiş sperm ve in vitro fertilizasyon, maternal CRISPR haploidleri oluşturmak için birleştirilir.
Bir haploidin oluşturulması, Sanger'ın maternal alelin dizilimini ve maternal CRISPR indellerinin tanımlanmasını sağlar. Bir maternal olmayan etki fenotipini tanımlarken, birden fazla F0 dişisinde gözlemleyebilmeniz önemlidir, çünkü fenotipin hedef dışı veya spesifik olmayan etkilerden değil, fonksiyon kaybından kaynaklanma olasılığını arttırır. Bir maternal etki fenotipi tanımlandıktan sonra, maternal CRISPR embriyoları, sinüs iskeleti veya DNA ayrışması gibi erken embriyogenezin çeşitli yönleri üzerindeki etkileri incelemek için kullanılabilir.
Bu, araştırmacıların fenotipin moleküler nedenini anlamalarını sağlar. Bu yöntem, bilinmeyen maternal olarak ifade edilen genlerin işlevini tek bir nesilde doğrudan test eder, süreçleri anlamamızı hızlandırır, erken embriyogenez sırasında hareket eder.
