Önceki yaklaşımlar, in vitro mezenkimal kök hücreler elde etmek için oldukça invaziv yöntemlere dayanıyordu, ancak bu mezenkimal kök hücrelerin% 30 ila% 60 arasında değişen verimlilikle% 30'luk heterojen havuz üretme sınırlaması vardıBurada, Nil kırmızısı kullanarak saf bir olgun adiposit popülasyonu üretebilen çok sayıda hızlı çoğalan mezenkimal kök hücre üretmek için bir protokol sunuyoruz. İPSC'ler% 80 birleşime ulaştığında, hücreleri DPBS ile yıkayın ve EDTA içeren ayrışma ortamı ekleyin. Hücreleri bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir dakika sonra, ayrışma reaktifini aspire edin ve hücreleri bir dakika daha 37 santigrat dereceye yerleştirin. Ardından, plakayı inkübatörden çıkarın. Kuyucuk başına bir mililitre StemFlex ortamı ekleyin ve hücreleri 15 mililitrelik bir konik tüpte dikkatlice toplayın.
Hücreleri santrifüj edin. Süpernatanı çıkarın ve bir kaya inhibitörünün 10 mikromolünü içeren üç mililitre MSC farklılaşma ortamında yavaşça askıya alın. Hücre süspansiyonunu karıştırın ve 24 kuyucuklu ultra düşük bir bağlantı plakasında kuyucuk başına 500 mikrolitre dağıtın.
Ardından plakayı 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. 24 saat sonra, elde edilen embriyonik cisimleri indüklemek için, onları 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve yerleşmelerine izin verin. 15 dakika sonra, süpernatantı çıkarın ve 10 mikromolar retinoik asit ile desteklenmiş MSC farklılaşma ortamı ekleyin.
Embriyonik cisimleri nazikçe yeniden askıya alın ve aynı 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasında kuyu başına 500 mikrolitre dağıtın. Sonra plakayı inkübatöre yerleştirin. 48 saat sonra, embriyonik cisimleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
Daha sonra süpernatantı çıkarın ve 0.1 mikromolar retinoik asit ile desteklenmiş MSC farklılaşma ortamı ekleyin. Embriyonik cisimleri yeniden askıya aldıktan sonra, aynı 24 delikli plakaya kuyucuk başına 500 mikrolitre dağıtın ve plakayı inkübatöre yerleştirin. Son retinoik asit tedavisinden kırk sekiz saat sonra, embriyonik cisimleri toplayın, süpernatanı çıkarın ve sitokinsiz DMEM düşük glikozlu ortam ekleyin.
Aynı 24 kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasında kuyu başına 500 mikrolitre hücre süspansiyonunu yavaşça askıya alın ve dağıtın, ardından plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. 48 saat sonra, iPSC türevi embriyonik cisimleri plakalamak için, embriyonik cisimleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın, yerleşmelerine izin verin, daha sonra süpernatanı çıkarın ve iki mililitre taze MSC farklılaşma ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, süspansiyonu bir bazal membran matris kaplı altı delikli plakanın iki kuyucuğuna aktarın ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.
Beş gün sonra, harcanan ortamı, mililitre bazik fibroblast büyüme faktörü başına 2.5 nanogram içeren taze bir MSC farklılaşma ortamı ile değiştirin ve MCS farklılaşmasına 11 ve 15 güne kadar devam edin. Kaplanmış embriyonik cisimler% 80 ila% 90 birleşime ulaştığında, DPBS ile yıkayarak, Tripsin-EDTA ekleyerek ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ederek bunları geçirin. Tripsin-EDTA'yı plakadan çıkarın ve bir dakika boyunca 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin.
Ardından, kuyu başına bir mililitre ortam ekleyin. Üç dakika sonra, MSC farklılaşma ortamını kullanarak hücreleri 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın ve hücreleri santrifüj edin. Daha sonra hücreleri temel fibroblast büyüme faktörü içeren bir MSC farklılaşma ortamında yeniden askıya alın ve hücreleri bazal membran matris kaplı plakalar üzerinde bir ila üç oranında plakalayın.
MSC'ler% 90'a ulaştıktan sonra, bir büyüme durması dönemine girmelerine izin vermek için onları 48 saat daha kültürlemeye devam edin. Ardından ortamı çıkarın ve hücreleri DBPS ile yıkayın. Yıkamadan sonra, plakaya tam adiposit farklılaşma ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ortamı 14 gün boyunca her gün değiştirin. iPSC türevi MSC'leri adipositlere ayırın. Adipositleri Nil kırmızısı kullanarak sıralamak için, metin makalesinde açıklandığı gibi DMSO'da Nil kırmızısı çalışma çözeltisi hazırlayın.
Kullanmadan önce, stok çözeltisini çözün ve 300-nanomolar çalışma çözeltisi konsantrasyonuna ulaşmak için DPBS'de yeniden oluşturun. Adiposit farklılaşmasının 14. gününde veya sonrasında, ortamı hücrelerden atın ve DPBS kullanarak yıkayın. Ardından Nil kırmızısı çalışma çözümünü ekleyin.
Plakayı örtün ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. 15 dakika sonra, Nil kırmızısı çözeltisini Tripsin-EDTA ile değiştirin ve hücreleri dört dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra 15 mililitrelik bir konik tüpte% 5 FBS içeren DMEM kullanarak hücreleri toplayın ve hücreleri santrifüj edin.
Süpernatantı çıkarın ve DPBS'deki hücreleri mililitre başına 1 milyon hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın. Daha sonra FACS sıralayıcısını kullanarak, FL-1 kanalını kullanarak Nil kırmızı-pozitif hücrelerini izole edin. Sıralanmış hücreleri toplayın ve bunları adiposit farklılaşma ortamında yeniden kültüre alın veya RNA ekstraksiyonuna devam edin, ardından adiposit farklılaşma belirteçlerinin kantitatif analizini yapın.
Farklılaşmayı başlattıktan sonra, süspansiyonla kaplanmış hücreler, tanımlanmış hücre kenarlıkları ile yuvarlaktır ve çapı küçük ila orta büyüklüktedir. Embriyonik cisimlerin yaşayabilirliği, daha fazla MSC'ye yol açan hızlı proliferasyon davranışı ile gözlenir. Bu hızlı proliferasyon davranışı, kendine özgü ve uzamış morfolojileri ile birlikte, MSC'leri taze matris kaplı plakalara geçirdikten sonra bile korunur.
İyi farklılaşma, mezenkimal yüzey belirteçleri CD73, CD44 ve CD90'ın% 90'ından fazla ekspresyon verimliliğine sahip güvenilir MSC'ler üretir. Ek olarak, hematopoetik fenotip CD14, CD34 ve CD19'u gösteren yüzey belirteçlerinin yokluğu açısından hücrelerin değerlendirilmesi,% 1'den az ekspresyon etkinliği gösterdi, Terminal olarak farklılaşmış adipositler için bir belirteç olan FABP4'ün sitoplazmik dağılımında yüksek ekspresyon, gelişimsel olgunluklarını gösterir. Ek olarak, adiposit olgunluğunun bir başka belirteci olan adiponektinin yüksek ekspresyonu, adipositlerin glikoz sinyalizasyonuna yanıt olarak lipit depolanması ve adipogeneze maruz kalacak kadar işlevsel olduğunu gösterir.
Boyama üzerine, Nil kırmızısı sadece lipit taşıyan olgun adipositlere bağlanır, bu da onu floresan ile aktive edilmiş akış sitometrisi kullanarak olgun adipositleri sıralamak için etkili bir araç haline getirir. Nil kırmızı-pozitif hücreleri, olgunlaşma belirteçlerinin sıralanmamış hücrelere kıyasla en az iki kat daha fazla düzenlenmesini gösterir. Embriyonik vücut oluşumu ve mezenkimal hücre ayrışması sırasında hücreleri toplarken çok nazik olmalısınız, çünkü bu mezenkimal kök hücrelerin ayrışmasından sonra hayatta kalma verimliliğini büyük ölçüde etkileyecektir.
Mutasyon taşıyan hastalardan elde edilen saf adiposit popülasyonu, veriler örnek heterojenliğinden etkilenmeden belirli mutasyondan etkilenen düzenleyici ve sinyal yollarını belirlemek için fonksiyonel ve tüm transkriptom dizilemesine tabi tutulabilir. Bu teknik, mezenkimal kök hücrelerin in vitro olarak ölçeklenebilir bir şekilde üretilmesine izin verecek ve doku ile ilişkili hastalık patogenezini anlamak için onları adipositlere, kondrositlere ve osteositlere kolayca ayırt etmek için insan donörlerinden toplama ihtiyacını ortadan kaldıracaktır.
