Questo metodo sperimentale consente la conservazione a lungo termine delle singole cellule riutilizzabili per i test epigenomici. Permette inoltre l'analisi di molti segni epigenetici e fattori di trascrizione nella stessa singola cellula. Negli attuali metodi per l'analisi dell'epigenoma a singola cellula, le stesse singole cellule non possono essere rianalizzate.
Tuttavia, con singole celle riutilizzabili, le stesse singole cellule possono essere rianalizzate molte volte. Questa tecnica è utile per la diagnosi e la progettazione della terapia epigenetica, in particolare quando le cellule del paziente sono limitate in numero. Questo metodo è più adatto allo studio dell'epigenoma, alla regolazione dell'espressione genica e ad altri sistemi purché siano disponibili anticorpi specifici per i marchi epigenetici.
Quando provi per la prima volta questa tecnica, ti consigliamo di esercitarti su campioni non troppo preziosi e di convalidare l'esperimento utilizzando un sequenziamento superficiale come MiSeq o iSeq 100. Per iniziare, in una cappa a flusso laminare pulita, mescolare un millilitro di sospensione cellulare e 199 millilitri di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA. Dopo la miscelazione, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.
Posizionare il coperchio sulla piastra a 96 pozzetti e scansionare la lastra utilizzando un microscopio a scansione. Quindi, inclinare la piastra e attendere alcuni minuti fino a quando la singola cella non è affondata sul bordo inferiore del pozzo. Quindi posizionare la punta della pipetta nell'angolo inferiore e trasferire la singola cella e il tampone in una provetta PCR.
Controllare il pozzetto utilizzando un microscopio a fluorescenza per confermare il trasferimento. Se una singola cellula è ancora nel pozzo, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di un PBS EDTA millimolare contenente un colorante intercalatore per il DNA e ripetere il trasferimento. Dopo il trasferimento, posizionare un coperchio sulla piastra PCR a 96 pozzetti e centrifugare la piastra utilizzando un rotore oscillante senza interruzioni.
Dopo la centrifugazione, posizionare la piastra sul ponte di un robot automatico per la movimentazione dei liquidi. Quindi, trascinare e rilasciare il codice supplementare uno nella finestra del software del robot di gestione dei liquidi ed eseguire il programma per rimuovere 195 microlitri di surnatante con una velocità di pipettaggio molto lenta. Aggiungere 50 microlitri di 4% TEMED o olio minerale e incubare la piastra durante la notte a temperatura ambiente.
Il giorno successivo, rimuovere l'olio minerale mediante pipettaggio e lavare le cellule cinque volte con 200 microlitri di tampone negativo al magnesio TP. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il surnatante, aggiungere 15 microlitri di tampone di ricottura e incubare sul ghiaccio per un'ora. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi PCR su un termociclatore e riscaldare a 94 gradi Celsius per tre minuti.
Quindi trasferire i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e incubare per due minuti. Quindi, aggiungere quattro microlitri di cloruro di solfato di magnesio-sodio, mescolare DNTP e mescolare a vortice alla massima velocità. Quindi aggiungere un microlitro di grande frammento di polimerasi BST, mescolare per vortice e incubare per quattro ore su uno shaker.
Dopo l'incubazione, posizionare il tubo PCR su un termociclatore ed eseguire un programma di quattro ore o durante la notte come descritto nel testo. Per il legame anticorpale, aggiungere 1,625 microlitri di soluzione di cloruro di sodio EDTA BSA al tubo. Mescolare vorticando a bassa velocità e incubare il tubo sul ghiaccio per un'ora.
Quindi aggiungere 0,1 microgrammi per millilitro di anticorpo e controllare le IgG coniugate con la sonda anticorpale. Dopo aver aggiunto gli anticorpi, incubare i tubi sul ghiaccio con un leggero scuotimento. Il giorno successivo, lavare le celle due volte con 200 microlitri di tampone TPM-T su ghiaccio.
Quindi rimuovere il surnatante e lavare una volta con tampone T4 DNA ligasi. Quindi, aggiungere 19 microlitri di soluzione adattatore di legatura e incubare per un'ora a 25 gradi Celsius. Quindi, aggiungere un microlitro di DNA ligasi T4 e mescolare il tubo vorticando a velocità media.
Posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di legatura di prossimità. Dopo la corsa, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone positivo EDTA negativo al magnesio BST e conservare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare le cellule due volte con 200 microlitri di tampone negativo EDTA negativo al magnesio BST e aggiungere 20 microlitri di una miscela contenente BST, DNTP e solfato di magnesio.
Quindi mescolare con un miscelatore a vortice e incubare il tubo per quattro ore su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, posizionare il tubo su un termociclatore ed eseguire il programma di estensione completo come descritto nel manoscritto testuale. Successivamente, per l'amplificazione a spostamento multiplo, aggiungere 0,4 microlitri di 100 micromolari di secondo primer casuale e mescolare per vortice.
Quindi, incubare il tubo per due ore su uno shaker orbitale prima di posizionare il tubo su un termociclatore per il riscaldamento a 94 gradi Celsius. Dopo tre minuti, posizionare i tubi in un blocco metallico raffreddato a ghiaccio e aggiungere un microlitro di DNA polimerasi BST. Vortice i tubi a bassa velocità.
Quindi posizionare i tubi su un termociclatore per eseguire il programma di amplificazione a spostamento multiplo. Dopo il programma, trasferire circa 20 microlitri di surnatante in un tubo PCR e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 20 microlitri di tampone TWEEN 20 e 0,1X TE allo 0,05% a un tubo PCR contenente la singola cellula riutilizzabile e incubare il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius.
Il giorno seguente, raccogliere il surnatante e combinarlo con il surnatante raccolto in precedenza. Quindi, immergere la singola cellula riutilizzabile e il tampone TBS contenente il 50% di glicerolo, cinque millimolari EDTA, 0,5% BSA e 0,05% TWEEN 20, quindi incubarlo per 30 minuti su uno shaker orbitale. Dopo l'incubazione, conservare la singola cella riutilizzabile a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.
Infine, aggiungere 40 microlitri di miscela master Exo negativa e posizionare il tubo su un termociclatore per eseguire il programma come descritto nel manoscritto testuale. Le singole celle riutilizzabili K562 sono state generate utilizzando questo protocollo. Le singole cellule sono state incorporate nello strato esterno della perla di poliacrilammide e visualizzate utilizzando un colorante intercalatore per la colorazione del DNA.
I prodotti a base di DNA prima e dopo la digestione di BciVI sono mostrati qui. La digestione enzimatica di restrizione ha generato i frammenti attesi da 19 a 20, da 31 a 32, 49 e superiori a 49 coppie di basi. Inoltre, la libreria di DNA costruita è stata analizzata mediante elettroforesi capillare per i prodotti desiderati.
I risultati del sequenziamento hanno indicato che le letture mappate uniche dell'anti-istone H3 acetilata lisina 27 e dell'anti-istone H3 trimetilata lisina 27 erano significativamente più numerose rispetto alle IgG di controllo. I segnali di sequenziamento REpi sono stati valutati confrontando i dati di sequenziamento REpi con i dati di sequenziamento ChIP di massa. In media, circa il 91% dei segnali di lisina 27 acetilata H3 dell'istone dal sequenziamento REpi si sovrapponevano ai picchi di lisina 27 acetilata dell'istone H-3 nel sequenziamento ChIP di massa.
La precisione del sequenziamento REpi per il segno istonico inattivo, istone H3 trimetilata lisina 27 era 52% La sensibilità del sequenziamento REpi è stata analizzata per misurare quanti picchi di sequenziamento ChIP di massa sono stati rilevati dal sequenziamento REpi riprodotto letture. La sensibilità del sequenziamento REpi è stata del 55,30% nell'istone H3 acetilata lisina 27 e del 50,94% nell'istone H3 trimetilata lisina 27. Assicurati di utilizzare reagenti privi di DNS.
Inoltre, tutte le operazioni che coinvolgono i cavi del tubo di apertura o i cavi del reagente devono essere eseguite in una cappa pulita. I prodotti del DNA di questa procedura vengono sequenziati e quindi mappati sul genoma per rivelare quali modifiche istoniche sono presenti, in quali regioni del genoma in singole cellule. Questa tecnologia ha permesso di analizzare più segni epigenetici nella stessa singola cellula e ha aperto la strada all'analisi multiomica in ogni singola cellula.
