Bu protokol, iki doğuştan gelen lenfoid hücreyi murin burun mukozasından izole etmek ve tanımlamak ve ILC ikisinin burun hastalıklarında belirli etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını araştırmak için kurulmuştur. Bu teknik, araştırmacıların ILC ikisini lokal mezotelyalden izole etmelerini ve yüzey antijeninin ekspresyonunu akış sitometrisi ile ortaya çıkarmalarını sağlar. Tekniğimiz karmaşık işlemleri içermez.
Bununla birlikte, önemli bir şey, yakındaki diğer dokuların etkisinden kaçınmak için küçük kemiklere yapışan eti tamamen çıkarmaya çalışmaktır Deneye başlamadan önce, 8 ila 12 haftalık vahşi tip C57 siyah altı erkek ve dişi fareyi, standart laboratuvar chow ve su ile sağlanan spesifik patojen içermeyen koşullar altında barındırın. Alerjik rinit modelini oluşturmak için, iki miligram alüminyum hidroksit içeren 0.2 mililitre steril PBS'de 50 mikrogram ovalbümini emülsifiye edin ve intraperitoneal olarak sıfır, yedi ve 14 günde her fareye 50 mikrogram emülsifiye ovalbümin enjekte edin. 21, 22, 23, 24 ve 25. günlerde, 30 mikrolitre steril PBS içinde çözünmüş 50 mikrogram ovalbümin ile intranazal olarak farelere aşılanır, ardından son meydan okumadan 24 saat sonra fareleri ötenazi yapar.
Ötanazi farenin başını beş dakika boyunca% 75 etanol içinde bekletin ve etanolün dış burun deliğine girmesini önleyin. Karnı ameliyat masasına aşağı doğru yerleştirin. Dört dişi kesin ve başın orta hattında bir kesi yapın ve makas kullanarak cildi kesin.
Ardından, alt çeneyi çıkarın, damağın ucu boyunca tüm burnu kesin ve dokuyu beş litre buz gibi PBS içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Makas ve forseps kullanarak, kemiklere yapışan eti ve kasları çıkarın. Ardından, fare burnunu beş mililitre buz gibi PBS içeren yeni bir 60 milimetrelik Petri kabına aktarın ve kemikleri yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, burnu 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Dokuyu yeterince parçalayın ve iki mililitre önceden ısıtılmış sindirim tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kapağı sabitleyin ve tüpü 40 dakika boyunca 37 santigrat derece ve 120 ila 150 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcıya dikey olarak yerleştirin.
Ardından, sindirimi durdurmak için% 10 fetal sığır serumu içeren beş mililitre buz gibi RPMI 1640 ortamı ekleyin. Ardından, katı parçaları çıkarmak için içeriği 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Filtratı beş dakika boyunca 500 G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatantı yavaşça atın ve peleti buz gibi soğuk RPMI 1640 ortamında yeniden askıya alın.
Santrifüjlemeyi daha önce gösterildiği gibi tekrarlamak için, hücre peletini dört mililitre% 40 yoğunluklu gradyan ortamında yeniden askıya alın. Ardından, 2,5 mililitre %80 yoğunluklu gradyan ortamı eklemek için tüpün altına yavaşça bir Pasteur pipet yerleştirin. Hızlanma ve yavaşlama oranı üçüncü vitesten daha düşük olacak şekilde tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 G'de santrifüj edin.
Arayüzdeki hücreleri boşaltmadan önce, potansiyel kontaminasyonu önlemek için üst safsızlık tabakasını temizleyin. Ardından, mononükleer hücrelerin katmanını% 40 ila% 80 yoğunluklu gradyan ortam arayüzünde, iki mililitre buz gibi soğuk içeren 15 mililitrelik bir tüpe boşaltmak için bir pipet kullanın. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.
Hücreleri hasat edin ve dört santigrat derecede 500 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletini boyama tamponunda tekrar askıya alın ve 500 G'de beş dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Hücreleri 80 mikrolitre bloke edici çözelti içinde karanlık durumda dört santigrat derecede 30 dakika boyunca yeniden askıya alın ve inkübe edin.
Numuneye uygun seyreltmenin 20 mikrolitre yüzey boyama antikor kokteylini eklemeden hemen önce bir mikrolitre sabitlenebilir canlılık boyası 520 ekleyin. Ayrıca, eşleşen izotip antikorlarını ve floresan eksi birini negatif kontroller olarak ayarlayın. Daha sonra, hücreleri 500 mikrolitre boyama tamponunda, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de santrifüj yaparak yıkayın.
Daha sonra hücre peletini 200 mikrolitre boyama tamponunda yeniden askıya alın. Son olarak, lekeli hücrelere 50 mikrolitre vorteksli mutlak sayma boncuğu ekleyin. Ajite edin ve onları bir akış sitometri analizine tabi tutun.
İki doğuştan gelen lenfoid hücre grubunun rolünü araştırmak için geliştirilen ova kaynaklı bir murin modeli, alerjik rinit farelerinde burun sürtünme ve hapşırma sıklığının kontrol grubuna göre anlamlı derecede yüksek olduğunu göstermiştir. Sağlıklı kontrol farelerinin burun mukozasında, soy negatif ve CD 45 pozitif hücrelerin yaklaşık% 2 ila 3'ü tanımlanmıştır. Grup iki doğuştan gelen lenfoid hücrenin mutlak sayısı 2.000 ila 4.000 arasında değişmiştir.
Akım sitometri analizi, alerjik rinit burun mukozasındaki grup iki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin toplam sayısında, sağlıklı kontrol farelerine kıyasla kayda değer bir artış olduğunu göstermiştir. Allerjik rinit farelerinde iki doğuştan gelen lenfoid hücrenin grubunda kontrol farelerine göre daha yüksek CD 226 ekspresyonu tespit edildi. Ek olarak, CD 226'nın ortalama floresan yoğunluğu, AR farelerde önemli ölçüde yukarı regüle edildi.
Burun kemiğine yapışan etin çıkarılması, ortamın santrifüj edilmesi ve mononükleer hücrelerin boşaltılması sırasında hızlanma ve yavaşlama oranının ayarlanması adımlarının farkında olun. Tanımlanan ILC ikilileri, hücre kültürü için sıralanmış veya in vitro olarak uyarılmış akış sitometri karakterizasyonu için bir stand olabilir, bu da burun dokusunda ILC ikililerinin spesifik riskini keşfetmeye yardımcı olur. Özellikle burun mukozasındaki doğuştan gelen lenfatik hücrelerde lenfositi izole etme ve karakterize etme prosedürü, bu protokolü yerel nazal bağışıklık ortamını araştıran araştırmacılar için bir ön referans haline getirir.
