Este protocolo é estabelecido para isolar e identificar o grupo duas células linfoides inatas da mucosa nasal murina e explorar os efeitos e mecanismos subjacentes da CIE dois em doenças nasais. Essa técnica permite aos pesquisadores isolar a ILC dois do mesotélio local e expor a expressão do antígeno de superfície por citometria de fluxo. Nossa técnica não inclui operações complicadas.
No entanto, uma coisa importante é tentar remover a carne aderida aos ossinhos completamente para evitar o impacto de outros tecidos próximos Antes de iniciar o experimento, abrigar seis camundongos machos e fêmeas machos e fêmeas do tipo selvagem C57 com idades entre 8 e 12 semanas sob condições específicas livres de patógenos fornecidos com ração padrão de laboratório e água. Para estabelecer o modelo de rinite alérgica, emulsionar 50 microgramas de ovalbumina em 0,2 mililitros de PBS estéril contendo dois miligramas de hidróxido de alumínio e injetar intraperitonealmente 50 microgramas de ovalbumina emulsionada em cada camundongo em zero, sete e 14 dias. Nos dias 21, 22, 23, 24 e 25, instilar por via intranasal camundongos com 50 microgramas de ovalbumina dissolvida em 30 microlitros de PBS estéril, seguido de eutanásia 24 horas após o último desafio.
Mergulhe a cabeça do camundongo eutanasiado em etanol 75% por cinco minutos e evite a entrada de etanol na narina externa. Coloque o abdome para baixo na mesa de cirurgia. Corte os quatro dentes e na linha média da cabeça faça uma incisão e abra a pele usando tesoura.
Em seguida, remova a mandíbula inferior, corte todo o nariz ao longo da extremidade do palato e coloque o tecido em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo cinco litros de PBS gelado. Usando tesouras e pinças, remova a carne e os músculos aderidos aos ossos. Em seguida, transfira o nariz do rato para uma nova placa de Petri de 60 milímetros contendo cinco mililitros de PBS gelado e lave os ossos.
Após a segunda lavagem, transfira o nariz para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Esmague suficientemente o tecido e transfira-o para um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de digestão pré-aquecido. Fixe a tampa e coloque o tubo verticalmente em um agitador orbital a 37 graus Celsius e 120 a 150 RPM por 40 minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio RPMI 1640 gelado contendo 10% de soro bovino fetal para interromper a digestão. Em seguida, filtre o conteúdo através de um filtro de células de 70 mícrons para remover fragmentos sólidos. Depois de centrifugar o filtrado a 500 G por cinco minutos, descarte suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio RPMI 1640 gelado.
Para repetir a centrifugação como demonstrado anteriormente, ressuspenda o pellet de células em quatro mililitros de meio com gradiente de densidade de 40%. Em seguida, insira suavemente uma pipeta de Pasteur no fundo do tubo para adicionar 2,5 mililitros de meio gradiente de densidade de 80%. Centrifugar o tubo a 400 G durante 15 minutos à temperatura ambiente com a taxa de aceleração e desaceleração regulada inferior à terceira velocidade.
Antes de drenar as células na interface, remova a camada superior de impurezas para evitar possíveis contaminações. Em seguida, use uma pipeta para drenar a camada das células mononucleares na interface de meio de gradiente de densidade de 40% por 80% em um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de gelo gelado. Lave as células com PBS gelado duas vezes.
Colha as células e centrifuja-as durante cinco minutos a 500 G a quatro graus Celsius. Ressuspender o pellet de célula em tampão de coloração e centrifugar novamente por cinco minutos a 500 G.Descarte o sobrenadante. Ressuspender e incubar as células em solução de bloqueio de 80 microlitros por 30 minutos a quatro graus Celsius na condição escura.
Adicione um microlitro de corante de viabilidade fixável 520 imediatamente antes de adicionar 20 microlitros do coquetel de anticorpos de coloração de superfície da diluição apropriada à amostra. Além disso, defina os anticorpos isotípicos correspondentes e a fluorescência menos um como os controles negativos. Em seguida, lave as células em 500 microlitros de tampão de coloração centrifugando a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 200 microlitros de tampão corante. Finalmente, adicione 50 microlitros de contas de contagem absoluta de vórtice às células coradas. Agitá-los e submetê-los a uma análise de citometria de fluxo.
Um modelo murino induzido por óvulos desenvolvido para explorar o papel das células linfoides inatas do grupo dois mostrou que a frequência de fricção nasal e espirros nos camundongos com rinite alérgica foi significativamente maior do que no grupo controle. Na mucosa nasal de camundongos controles saudáveis, cerca de 2 a 3% das células negativas da linhagem e CD 45 positivas foram identificadas. O número absoluto de células linfoides inatas do grupo dois variou de 2.000 a 4.000.
A análise por citometria de fluxo indicou um aumento notável no número total de células linfoides inatas do grupo dois na mucosa nasal da rinite alérgica em comparação com a de camundongos controles saudáveis. Maior expressão de CD 226 foi detectada no grupo duas células linfoides inatas nos camundongos com rinite alérgica do que nos controles. Além disso, a intensidade média de fluorescência do CD 226 foi significativamente aumentada nos camundongos AR.
Fique atento aos passos de remoção da carne aderida ao osso nasal, definindo a taxa de aceleração e desaceleração ao centrifugar o meio e drenar as células mononucleares. Os dois ILC identificados podem ser um suporte para a caracterização por citometria de fluxo classificados para cultura celular ou estimulados in vitro, o que ajudaria a explorar o risco específico de dois ILC no tecido nasal. Este procedimento de isolamento e caracterização de linfócitos, particularmente em células linfáticas inatas na mucosa nasal, torna este protocolo uma referência preliminar para pesquisadores que exploram o ambiente imune nasal local.
