이 프로토콜은 쥐 비강 점막에서 그룹 2 선천성 림프 세포를 분리 및 식별하고 비강 질환에서 ILC 2의 특정 효과 및 기본 메커니즘을 탐색하기 위해 확립되었습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 국소 중피에서 ILC 2를 분리하고 유세포 분석을 통해 표면 항원의 발현을 노출시킬 수 있습니다. 우리의 기술에는 복잡한 작업이 포함되지 않습니다.
그러나, 한 가지 중요한 것은 다른 주변 조직의 영향을 피하기 위해 작은 뼈에 붙어있는 살을 완전히 제거하려고 노력하는 것입니다 실험을 시작하기 전에, 8 내지 12 주령의 야생형 C57 검정 6 마리의 수컷 및 암컷 마우스를 표준 실험실 차우와 물이 제공된 특정 병원체가없는 조건 하에서 집어 넣었다. 알레르기성 비염 모델을 확립하기 위해, 2mg의 수산화알루미늄을 함유한 0.2 밀리리터의 멸균 PBS에 50 마이크로그램의 오브알부민을 유화시키고, 0일, 7 및 14일에 각 마우스에 50 마이크로그램의 유화된 오브알부민을 복강 주사한다. 21일, 22일, 23일, 24일 및 25일에 30마이크로리터의 멸균 PBS에 용해된 50마이크로그램의 오브알부민을 마우스에 비강 내 주입한 다음, 마지막 챌린지 후 24시간 후에 마우스를 안락사시켰다.
안락사된 쥐의 머리를 75% 에탄올에 5분 동안 담그고 에탄올이 외부 콧구멍으로 들어가지 않도록 합니다. 복부를 수술대에 아래쪽으로 놓습니다. 4 개의 치아를 잘라 내고 머리의 정중선을 절개하고 가위로 피부를 자릅니다.
그런 다음 아래턱을 제거하고 입천장 끝을 따라 코 전체를 잘라낸 다음 5리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 60mm 페트리 접시에 조직을 넣습니다. 가위와 집게를 사용하여 뼈에 붙어있는 살과 근육을 제거하십시오. 다음으로, 5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어있는 새로운 60 밀리미터 페트리 접시에 마우스 코를 옮기고 뼈를 씻으십시오.
두 번째 세척 후 코를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 조직을 충분히 부수고 2 밀리리터의 예열 된 소화 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 뚜껑을 덮고 튜브를 섭씨 37도, 120-150RPM의 궤도 셰이커에 수직으로 40분 동안 놓습니다.
다음으로, 소화를 멈추기 위해 10% 소 태아 혈청을 함유한 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지 5밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 내용물을 여과하여 고체 조각을 제거합니다. 여과액을 500G에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 부드럽게 버리고 펠릿을 얼음처럼 차가운 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다.
앞에서 설명한 대로 원심분리를 반복하려면 40% 밀도 구배 배지 4밀리리터에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫을 튜브 바닥에 부드럽게 삽입하여 2.5ml의 80% 밀도 구배 매체를 추가합니다. 튜브를 400G에서 실온에서 15분 동안 원심분리하고 가속 및 감속 속도를 3단 기어보다 낮게 설정합니다.
계면에서 셀을 배출하기 전에 잠재적인 오염을 방지하기 위해 불순물의 최상층을 제거하십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 40% x 80% 밀도 구배 매체 계면의 단핵 세포층을 2밀리리터의 얼음이 들어 있는 15밀리리터 튜브로 배출합니다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척한다.
세포를 수확하고 섭씨 4도에서 500G에서 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠렛을 염색 완충액에 재현탁하고 500G에서 5분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 버립니다. 세포를 80 마이크로리터 차단 용액에 재현탁하고 어두운 조건에서 섭씨 4도에서 30분 동안 배양한다.
적절한 희석액의 20 마이크로리터의 표면 염색 항체 칵테일을 샘플에 첨가하기 직전에 1 마이크로리터의 고정가능한 생존성 염료 520을 첨가한다. 또한 일치하는 이소타입 항체와 형광 마이너스 1을 음성 대조군으로 설정합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G에서 원심분리하여 500 마이크로리터의 염색 완충액으로 세포를 세척한다.
그런 다음 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 염색 완충액에 재현탁합니다. 마지막으로, 50 마이크로리터의 와류된 절대 계수 비드를 염색된 세포에 추가합니다. 교반하고 유세포 분석 대상에 적용합니다.
그룹 2 선천성 림프 세포의 역할을 탐색하기 위해 개발된 난자 유도 쥐 모델은 알레르기성 비염 마우스에서 비강 마찰 및 재채기 빈도가 대조군보다 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다. 건강한 대조군 마우스의 코 점막에서 약 2 내지 3%의 계통 음성 및 CD 45 양성 세포가 확인되었다. 그룹 2 선천성 림프 세포의 절대 수는 2, 000에서 4, 000까지 다양했습니다.
유세포 분석 결과, 알러지성 비염 코 점막에서 건강한 대조군 마우스에 비해 그룹 2 선천성 림프 세포의 총 수가 현저하게 증가한 것으로 나타났습니다. CD 226의 더 높은 발현은 대조군 마우스에서보다 알러지성 비염 마우스에서 2개의 선천성 림프 세포군에서 검출되었다. 또한, CD 226의 평균 형광 강도는 AR 마우스에서 유의하게 상향 조절되었다.
비강 뼈에 부착 된 살을 제거하고, 배지를 원심 분리하고, 단핵 세포를 배출 할 때 가속 및 감속 속도를 설정하는 단계를 알고 있어야합니다. 확인된 ILC 2는 세포 배양을 위해 분류되거나 시험관 내에서 자극되는 유세포 분석 특성 분석을 위한 스탠드가 될 수 있으며, 이는 비강 조직에서 ILC 2의 특정 위험을 탐색하는 데 도움이 될 것입니다. 특히 비강 점막의 선천성 림프 세포에서 림프구를 분리하고 특성화하는 이 절차는 이 프로토콜을 국소 비강 면역 환경을 탐구하는 연구자들을 위한 예비 참고 자료로 만듭니다.
