פרוטוקול זה הוקם כדי לבודד ולזהות את קבוצת שני תאי הלימפה המולדים מרירית האף ולחקור את ההשפעות המסוימות והמנגנונים הבסיסיים של ILC 2 במחלות אף. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבודד ILC 2 ממזותל מקומי ולחשוף את הביטוי של אנטיגן פני השטח על ידי ציטומטריית זרימה. הטכניקה שלנו לא כוללת פעולות מסובכות.
עם זאת, דבר חשוב אחד הוא לנסות להסיר את הבשר דבק העצמות הקטנות לחלוטין כדי למנוע את ההשפעה של רקמות סמוכות אחרות לפני תחילת הניסוי, בית בר סוג C57 שחור שישה עכברים זכרים ונקבות בגילאי 8 עד 12 שבועות בתנאים ספציפיים ללא פתוגן מסופק עם צ'או מעבדה סטנדרטי ומים. כדי לבסס את מודל הנזלת האלרגית, תחליבו 50 מיקרוגרם של אובלבומין ב -0.2 מיליליטר של PBS סטרילי המכיל שני מיליגרם של אלומיניום הידרוקסיד והזריקו תוך צפקית 50 מיקרוגרם של אובלבומין מתחלב לכל עכבר על אפס, שבעה ו -14 ימים. בימים 21, 22, 23, 24 ו-25, החדרת עכברים תוך אפיים עם 50 מיקרוגרם של אובאלבומין מומס ב-30 מיקרוליטר של PBS סטרילי, ולאחר מכן המתת חסד של העכברים 24 שעות לאחר האתגר האחרון.
השרו את ראשו של העכבר שעבר המתת חסד באתנול 75% למשך חמש דקות והימנעו מכניסת אתנול לנחיר החיצוני. הניחו את הבטן כלפי מטה על שולחן הניתוחים. חותכים את ארבע השיניים ובקו האמצע של הראש עושים חתך וחותכים את העור באמצעות מספריים.
לאחר מכן, הסירו את הלסת התחתונה, חתכו את כל האף לאורך קצה החיך, והכניסו את הרקמה לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה חמישה ליטרים של PBS קר כקרח. בעזרת מספריים ומלקחיים, להסיר את הבשר והשרירים דבק העצמות. לאחר מכן, העבירו את אף העכבר לצלחת פטרי חדשה בקוטר 60 מ"מ המכילה חמישה מיליליטר PBS קר כקרח ושטפו את העצמות.
לאחר השטיפה השנייה, להעביר את האף לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. מספיק לרסק את הרקמה ולהעביר אותו לצינור 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של חיץ העיכול שחומם מראש. הדקו את המכסה והניחו את הצינור אנכית בשייקר מסלולי, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-120 עד 150 סל"ד למשך 40 דקות.
לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 קר כקרח המכיל 10% סרום בקר עוברי כדי לעצור את העיכול. לאחר מכן סנן את התוכן דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי להסיר שברים מוצקים. לאחר צנטריפוגה של התסנין ב 500 גרם במשך חמש דקות, להשליך בעדינות את supernatant ולתלות מחדש את הגלולה בסל"ד קר כקרח 1640 בינוני.
כדי לחזור על הצנטריפוגה כפי שהודגם קודם, השהה מחדש את גלולת התא בארבעה מיליליטר של מדיה הדרגתית בצפיפות של 40%. לאחר מכן, הכנס בעדינות צינור פסטר לתחתית הצינור כדי להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיה הדרגתית בצפיפות של 80%. צנטריפוגה את הצינור ב-400 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כאשר קצב ההאצה וההאטה מוגדר נמוך יותר מההילוך השלישי.
לפני ניקוז התאים בממשק, להסיר את השכבה העליונה של זיהומים כדי למנוע זיהום פוטנציאלי. לאחר מכן השתמש בצינור כדי לנקז את שכבת התאים החד-גרעיניים בממשק המדיה ההדרגתית בצפיפות של 40% על 80% לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר קר כקרח. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים.
קצרו את התאים וצנטריפוגו אותם במשך חמש דקות ב-500 גרם בארבע מעלות צלזיוס. השהה שוב את גלולת התא בחיץ מכתים ובצנטריפוגה למשך חמש דקות ב 500 G.השליכו את הסופרנטנט. להשהות מחדש ולדגור על התאים בתמיסה חוסמת 80 מיקרוליטר למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס במצב חשוך.
יש להוסיף מיקרוליטר אחד של צבע 520 הניתן לתיקון ממש לפני הוספת 20 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים מכתימי פני השטח של הדילול המתאים לדגימה. כמו כן, הגדר את נוגדני האיזוטיפ התואמים ואת הפלואורסצנטיות מינוס אחד כבקרות השליליות. לאחר מכן, לשטוף את התאים ב 500 מיקרוליטר של חיץ צביעה על ידי צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 מיקרוליטר של חיץ מכתים. לבסוף, הוסיפו 50 מיקרוליטר של חרוזי ספירה מוחלטת מערבולת לתאים המוכתמים. להתסיס ולהכפיף אותם לניתוח ציטומטריה זרימה.
מודל מורין המושרה בביציות שפותח כדי לחקור את תפקידם של תאי הלימפה המולדים מקבוצה 2 הראה כי תדירות שפשוף האף והתעטשות בעכברי נזלת אלרגית הייתה גבוהה משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת. ברירית האף של עכברי ביקורת בריאים, זוהו כ-2% עד 3% מתאי השושלת השליליים ו-CD 45 חיוביים. המספר המוחלט של קבוצת שני תאי לימפה מולדים נע בין 2, 000 ל -4, 000.
ניתוח ציטומטריית הזרימה הצביע על עלייה מרשימה במספר הכולל של תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 ברירית האף אלרגית נזלת בהשוואה לזו של עכברי ביקורת בריאים. ביטוי גבוה יותר של CD 226 זוהה בקבוצה של שני תאי לימפה מולדים בעכברי נזלת אלרגית מאשר בעכברי הביקורת. בנוסף, עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של CD 226 הייתה מווסתת באופן משמעותי בעכברי AR.
להיות מודעים לשלבים של הסרת הבשר דבק עצם האף, קביעת קצב האצה והאטה בעת צנטריפוגה התקשורת ואת ניקוז התאים המונוגרעיניים. שני ILC המזוהים יכולים להיות ראשי תיבות של אפיון ציטומטריית זרימה הממוינת עבור תרבית תאים או מגורה במבחנה, אשר תסייע לחקור את הסיכון הספציפי של שני ILC ברקמת האף. הליך זה של בידוד ואפיון לימפוציטים, במיוחד בתאי לימפה מולדים ברירית האף, הופך פרוטוקול זה להתייחסות ראשונית עבור חוקרים החוקרים את הסביבה החיסונית המקומית באף.
