从小鼠鼻粘膜中分离第2组先天淋巴细胞以检测CD226的表达

本协议旨在从小鼠鼻粘膜中分离和鉴定第二组先天淋巴细胞，并探讨ILC 2在鼻腔疾病中的某些作用和潜在机制。该技术使研究人员能够从局部间皮中分离ILC 2，并通过流式细胞术暴露表面抗原的表达。我们的技术不包括复杂的操作。

然而，一件重要的事情是试图完全去除粘附在小骨头上的肉，以避免附近其他组织的影响 在开始实验之前，在无病原体的特定条件下，将野生型C57黑六只雄性和雌性小鼠在无病原体条件下提供标准实验室食物和水。为了建立过敏性鼻炎模型，将50微克卵清蛋白乳化在含有2毫克氢氧化铝的0.2毫升无菌PBS中，并在0，7和14天腹膜内注射50微克乳化卵清蛋白到每只小鼠中。在第21，22，23，24和25天，鼻内给小鼠灌注溶解在30微升无菌PBS中的50微克卵清蛋白，然后在最后一次挑战后24小时对小鼠实施安乐死。

将安乐死小鼠的头部浸泡在75%乙醇中五分钟，避免乙醇进入外鼻孔。将腹部向下放在手术台上。切掉四颗牙齿，在头部的中线做一个切口，用剪刀切开皮肤。

然后，移除下颌，沿着上颚末端切掉整个鼻子，并将组织放入含有五升冰冷PBS的60毫米培养皿中。使用剪刀和镊子去除粘附在骨头上的肉和肌肉。接下来，将小鼠鼻子转移到装有五毫升冰冷PBS的新60毫米培养皿中并清洗骨头。

第二次洗涤后，将鼻子转移到1.5毫升微量离心管中。充分粉碎组织并将其转移到含有两毫升预热消化缓冲液的 15 毫升管中。盖上盖子并将管子垂直放置在 37 摄氏度和 120 至 150 RPM 的轨道摇床中 40 分钟。

接下来，加入五毫升含有10%胎牛血清的冰冷RPMI 1640培养基以停止消化。然后通过70微米的细胞过滤器过滤内容物以去除固体碎片。将滤液以500G离心五分钟后，轻轻弃去上清液并将沉淀重悬于冰冷的RPMI 1640培养基中。

为了重复如前所示的离心，将细胞沉淀重悬于四毫升40%密度梯度培养基中。接下来，轻轻地将巴斯德移液管插入管底部，以加入 2.5 毫升 80% 密度梯度培养基。在室温下以400 G离心管15分钟，加速和减速率设置为低于三档。

在排出界面处的细胞之前，请去除顶层杂质以避免潜在污染。然后使用移液管将40%×80%密度梯度培养基界面处的单核细胞层排出到含有两毫升冰冷的15毫升管中。用冰冷的PBS清洗细胞两次。

收获细胞并在 500 G 和 4 摄氏度下离心五分钟。将细胞沉淀重悬于染色缓冲液中，并在500G下再次离心5分钟，弃去上清液。在黑暗条件下，将细胞重悬并在80微升封闭溶液中在4摄氏度下孵育30分钟。

在向样品中加入20微升适当稀释度的表面染色抗体混合物之前，加入1微升可固定活性染料520。此外，将匹配的同种型抗体和荧光减一设置为阴性对照。接下来，通过在 500 倍 G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟，在 500 微升染色缓冲液中洗涤细胞。

然后将细胞沉淀重悬于200微升染色缓冲液中。最后，向染色细胞中加入50微升涡旋绝对计数珠。搅拌并对其进行流式细胞术分析。

为探索第二组先天淋巴细胞的作用而开发的卵诱导小鼠模型显示，过敏性鼻炎小鼠揉鼻和打喷嚏的频率明显高于对照组。在健康对照小鼠的鼻粘膜中，鉴定出约2%至3%的谱系阴性和CD 45阳性细胞。第二组先天淋巴细胞的绝对数量从2， 000到4， 000不等。

流式细胞术分析表明，与健康对照小鼠相比，过敏性鼻炎鼻粘膜中第二组先天淋巴细胞总数显着增加。在过敏性鼻炎小鼠的第二组先天淋巴细胞上检测到的CD 226表达高于对照小鼠。此外，在AR小鼠中，CD 226的平均荧光强度显着上调。

注意去除粘附在鼻骨上的肉的步骤，离心培养基和引流单核细胞时的加速和减速速率。鉴定出的ILC twos可以作为流式细胞术表征的支架，用于细胞培养或体外刺激，这将有助于探索ILC twos在鼻组织中的特定风险。这种分离和表征淋巴细胞的过程，特别是在鼻粘膜中的先天淋巴细胞中，使该方案成为探索局部鼻腔免疫环境的研究人员的初步参考。