このプロトコルは、マウス鼻粘膜からグループ2の自然リンパ系細胞を単離および同定し、鼻疾患におけるILC2の特定の効果および根底にあるメカニズムを探求するために確立される。この技術により、研究者は局所中皮からILC 2を単離し、フローサイトメトリーによって表面抗原の発現を明らかにすることができます。私たちのテクニックには、複雑な操作は含まれていません。
しかし、重要なことの1つは、他の近くの組織の影響を避けるために、小さな骨に付着した肉を完全に除去しようとすることです実験を開始する前に、標準的な実験用固形飼料と水を備えた特定の病原体のない条件下で、8〜12週齢の野生型C57ブラック6匹のオスとメスのマウスを収容します。アレルギー性鼻炎モデルを確立するには、2ミリグラムの水酸化アルミニウムを含む0.2ミリリットルの滅菌PBSに50マイクログラムのオボアルブミンを乳化し、50マイクログラムの乳化オボアルブミンを各マウスに0日、7日、および14日に腹腔内注射します。21、22、23、24、および25日目に、30マイクロリットルの滅菌PBSに溶解した50マイクログラムのオボアルブミンをマウスに鼻腔内投与し、続いて最後のチャレンジの24時間後にマウスを安楽死させた。
安楽死させたマウスの頭を75%エタノールに5分間浸し、エタノールが外鼻孔に入らないようにします。腹部を手術台の下に置きます。4本の歯を切り取り、頭の正中線で切開し、ハサミを使って皮膚を切り開きます。
次に、下顎を取り外し、口蓋の端に沿って鼻全体を切り取り、5リットルの氷冷PBSを含む60ミリメートルのペトリ皿に組織を置きます。はさみと鉗子を使用して、骨に付着している肉と筋肉を取り除きます。次に、マウスの鼻を5ミリリットルの氷冷PBSを含む新しい60ミリメートルのペトリ皿に移し、骨を洗います。
2回目の洗浄後、鼻を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。組織を十分に粉砕し、2ミリリットルの予熱した消化バッファーを含む15ミリリットルのチューブに移します。蓋を締め、チューブを摂氏37度、120〜150RPMのオービタルシェーカーに40分間垂直に置きます。
次に、10%ウシ胎児血清を含む5ミリリットルの氷冷RPMI 1640培地を加えて消化を停止します。次に、70ミクロンのセルストレーナーで内容物をろ過し、固体片を除去します。ろ液を500Gで5分間遠心分離した後、上清を穏やかに廃棄し、ペレットを氷冷RPMI 1640培地に再懸濁します。
前に示したように遠心分離を繰り返すには、細胞ペレットを4ミリリットルの40%密度勾配培地に再懸濁します。次に、パスツールピペットをチューブの底にそっと挿入し、2.5ミリリットルの80%密度勾配培地を追加します。チューブを400Gで室温で15分間遠心分離し、加速と減速の速度を3速よりも低く設定します。
界面でセルを排出する前に、潜在的な汚染を避けるために不純物の最上層を取り除きます。次に、ピペットを使用して、40%x 80%密度勾配媒体界面にある単核細胞の層を、2ミリリットルの氷冷を含む15ミリリットルのチューブに排出します。氷冷PBSで細胞を2回洗浄します。
細胞を回収し、摂氏4度で500 Gで5分間遠心分離します。細胞ペレットを染色バッファーに再懸濁し、500 Gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。細胞を再懸濁し、80マイクロリットルのブロッキング溶液に暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。
適切な希釈液の20マイクロリットルの表面染色抗体カクテルをサンプルに加える直前に、1マイクロリットルの固定可能な生存率色素520を加える。また、一致するアイソタイプ抗体と蛍光マイナス1をネガティブコントロールとして設定する。次に、500倍Gで5分間、摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞を500マイクロリットルの染色バッファーで洗浄します。
次いで、細胞ペレットを200マイクロリットルの染色バッファーに再懸濁する。最後に、50マイクロリットルのボルテックスアブソリュートカウントビーズを染色細胞に加えます。撹拌し、フローサイトメトリー分析にかけます。
第2群の自然リンパ系細胞の役割を調べるために開発された卵子誘発マウスモデルは、アレルギー性鼻炎マウスの鼻こすりとくしゃみの頻度が対照群よりも有意に高いことを示しました。健常対照マウスの鼻粘膜において、約2〜3%の系統陰性およびCD45陽性細胞が同定された。グループ2の自然リンパ系細胞の絶対数は2, 000から4, 000まで変化しました。
フローサイトメトリー解析の結果、アレルギー性鼻粘膜の2群自然リンパ系細胞の総数は、健常対照マウスと比較して顕著に増加した。CD226の発現は、対照マウスよりもアレルギー性鼻炎マウスにおいて2群の自然リンパ系細胞で検出された。加えて、CD226の平均蛍光強度は、ARマウスにおいて有意にアップレギュレーションされた。
鼻骨に付着した肉を除去する工程、培地を遠心分離する際の加速・減速率の設定、単核球の排出工程に注意する。同定されたILC twoは、細胞培養用にソートされたフローサイトメトリー特性評価の略であるか、in vitroで刺激され、鼻組織におけるILC twoの特異的リスクの調査に役立ちます。リンパ球、特に鼻粘膜の自然リンパ細胞を分離して特徴付けるこの手順により、このプロトコルは、局所的な鼻免疫環境を探索する研究者にとって予備的なリファレンスになります。
